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用于孔雀石绿、阿特拉津残留检测的信号放大SPR传感技术研究

作　者: 彭媛
导　师: 高志贤
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 表面等离子体共振 信号放大 农兽药残留 分子印迹聚合物 免疫分析
分类号: R155.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


农兽药的不合理使用，导致其在土壤、水与农产品中的残留，造成环境污染并通过食物链的富集作用最终进入食品，从而引发食品安全等一系列问题，不仅严重影响人们的身体健康，而且致使我国食品和农产品出口遭遇国际贸易“绿色壁垒”，阻碍食品和农产品产业的健康发展。目前常用的检测方法包括气相色谱法、液相色谱法以及气-质、液-质联用方法等，这些方法大多需要复杂冗长的前处理过程，不能实现样品的快速检测。随着传感器技术的发展，表面等离子体共振(surface plasmonresonance, SPR)传感技术，具有实时、快速、无须标记和样品无损等优点而受到了人们的青睐，并被广泛应用于环境科学及食品和药物检测等领域。但由于某些样品基质复杂、待测物含量低，用SPR传感器直接进行检测时，信号响应较弱，灵敏度较低。因此，本研究基于SPR传感平台，结合分子印迹技术、免疫技术，并分别引入纳米金、纳米金标记的二抗、磁纳米颗粒作为信号放大材料，构建信号放大SPR传感系统，用于农兽药残留的检测。主要研究内容分为以下几个方面：1、基于纳米金信号放大的SPR分子印迹聚合膜的制备、表征及应用分子印迹聚合物(MIP)具有特异识别目标物的优势，且化学性质稳定，抗恶劣环境能力强，以其作为SPR传感器的识别元件，可以集分离、富集及检测为一体，再引入纳米金作为信号放大材料，初步构建纳米金信号放大的MIP-SPR传感系统：将十一巯基烷酸(MUA)修饰的纳米金加入预聚合液中，采用旋涂引发剂法，在SPR芯片表面原位聚合孔雀石绿(MG)的MIP膜及非印迹聚合物(NIP)膜。AFM表征结果表明，含有纳米金的MIP膜厚度为56nm，可以用作SPR敏感识别元件。研究了不同膜对不同浓度MG的吸附响应，结果显示，含有纳米金的MIP膜的SPR响应信号最大增加了一倍，成功实现信号放大。用纳米金信号放大的MIP-SPR传感系统检测MG，线性回归方程为Y=0.03X+6.15，r=0.9927。水样加标回收率为84%-110%。2、基于纳米金标记的二抗信号放大的SPR免疫传感技术研究生物抗体具备高特异性和高亲和力的特点，可以提高检测灵敏度和特异性，我们将免疫分析技术与SPR联用，并通过引入纳米金标记的二抗进行信号放大，从而进一步提高检测灵敏度。以阿特拉津(AT)为靶标，经过优化AT-OVA的固定化浓度、AT-mAb的使用浓度、再生液、再生时间、二抗的加入方式、种类及用量等条件，初步建立了用于检测AT的纳米金标记二抗信号放大的SPR免疫传感方法，该方法最低检出限为0.72ng/mL，检测范围2.18-629.06ng/mL，与未经信号放大的SPR免疫检测方法(最低检出限为2.34ng/mL，检测范围6.4-188.0ng/mL)相比，检出限更低，检测范围更宽，有效地改善了检测灵敏度。方法特异性实验表明，除扑草净外，结构功能类似物三聚氰胺，毒死蜱和2,4-D的抑制率均低于0.05，显示出良好的特异性。用该方法检测AT模拟水样，加标回收率为83~95%，相对标准偏差(RSD)低于5%。利用HPLC法进行方法比对，结果显示，纳米金标记的二抗信号放大的SPR免疫传感方法具有更高的灵敏度，更低的检出限。而且，该方法不会受样品体系本身性质如颜色和离子强度的影响，不需要进行样品前处理，适用于痕量AT的直接检测。此外，所有的试剂可以一步加入到检测体系中，免去了费时的孵育过程。3、基于磁颗粒信号放大的SPR免疫传感技术研究为了解决复杂样品基质前处理过程繁琐的问题，将磁纳米材料引入SPR检测体系，既可以作为前处理材料进行样品的分离、富集，又可以放大SPR传感信号，提高检测灵敏度。采用EDC/NHS活化法，把AT-mAb偶联到羧基修饰的磁纳米颗粒(MNP)表面，并优化AT-mAb及MNP的用量。将制备好的AT-mAb-MNP用于SPR传感体系，经优化结合时间、AT-mAb-MNP的使用浓度后，初步建立了用于检测AT的SPR间接竞争免疫传感方法，绘制了工作曲线，线性回归方程为Y=-0.0743+0.2397X，r=0.9924，IC50为74.77ng/mL，检测范围0.89-6309.57ng/mL，扩大了检测范围，信号放大效果明显。本研究基于分子印迹技术和免疫分析技术，分别考察纳米金、纳米金标记的二抗、磁纳米颗粒等材料对SPR传感信号的放大作用，初步建立了纳米金-MIP-SPR传感平台、纳米金标记的二抗-SPR及抗体-MNP-SPR免疫传感平台，并用于小分子农兽药残留的检测，结果表明，信号放大材料的引入可有效改善检测灵敏度，扩大检测范围，上述平台经进一步优化和改良，有望为其他相关研究领域，如环境监测、生物工程、临床医学、药物分析等提供高灵敏度、低检测限的分析手段，具有很好的实用价值和应用前景。

全文目录


目录  3-6
缩略词表  6-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
第一章 前言  12-23
  一、 国内外农兽药残留现状  12-16
    （一） 我国农兽药残留现状及其造成的危害  12-13
    （二） 孔雀石绿的危害  13-14
    （三） 阿特拉津的危害  14-15
    （四） MG 和 AT 的常用检测方法  15-16
  二、 分子印迹技术  16-17
  三、 表面等离子体共振(SPR)传感技术  17-20
    （一） SPR 传感技术  17-18
    （二） SPR-分子印迹(MIP)联用技术  18-19
    （三） SPR-免疫分析技术  19-20
  四、 研究目标、意义及内容  20-23
    （一） 研究目标  20-21
    （二） 研究内容及技术路线  21-23
第二章 基于纳米金信号放大的 SPR 分子印迹聚合膜的制备、表征及应用  23-32
  一、 材料与方法  23-26
    （一） 主要仪器与试剂  23-24
      1. 仪器与设备  23-24
      2. 主要试剂  24
    （二） 实验方法  24-26
      1. MUA 修饰的纳米金的制备  24
      2. 含有纳米金的 MIP 膜的制备  24-25
      3. 聚合物膜的表征  25
      4. SPR 检测  25-26
      5. 吸附响应实验  26
      6. 加标回收实验  26
  二、 结果与讨论  26-31
    1. MUA 修饰的纳米金的制备  26-27
    2. 聚合物膜的表征  27-29
    3. 吸附响应实验  29-31
    4. 加标回收实验  31
  三、 小结  31-32
第三章 基于金标二抗信号放大的 SPR 免疫传感技术检测阿特拉津  32-50
  一、 材料与方法  33-36
    （一） 主要仪器与试剂  33-34
      1. 仪器与设备  33
      2. 主要试剂  33-34
    （二） 主要试剂的配制  34-35
    （三） 实验方法  35-36
      1. AT 完全抗原(AT-OVA)的固定化  35
      2. 最佳抗体(AT-mAb)浓度的选择  35-36
      3. 再生条件的优化  36
      4. 间接竞争实验  36
      5. 信号放大的间接竞争 SPR 免疫分析实验  36
      6. 特异性实验  36
      7. 模拟实样的检测  36
      8. HPLC 比对实验  36
  二、 结果与讨论  36-48
    1. AT-OVA 的固定化  36-37
    2. 最佳抗体(AT-mAb)浓度的选择  37-39
    3. 再生条件的优化  39-40
    4. 间接竞争实验  40-42
    5. 信号放大的间接竞争 SPR 免疫分析实验  42-45
    6. 特异性实验  45-46
    7. 模拟实样的检测  46
    8. HPLC 比对实验  46-48
  三、 小结  48-50
第四章 基于磁颗粒信号放大的 SPR 免疫传感技术检测阿特拉津  50-61
  一、 材料与方法  51-54
    （一） 主要仪器与试剂  51-52
      1. 仪器与设备  51
      2. 主要试剂  51-52
    （二） 主要试剂的配制  52
    （三） 实验方法  52-54
      1. AT-OVA 的固定化及稳定性研究  52
      2. AT-mAb 与 MNP 偶联条件的优化  52-53
      3. AT-mAb-MNP 的表征  53
      4. SPR 检测条件的优化  53-54
      5. 间接竞争实验  54
  二、 结果与讨论  54-60
    1. AT-OVA 的稳定性研究  54
    2. AT-mAb 与 MNP 偶联条件的优化  54-56
    3. AT-mAb-MNP 的表征  56-57
    4. SPR 检测条件的优化  57-58
    5. 间接竞争实验  58-60
  三、 小结  60-61
结论  61-62
参考文献  62-73
综述  73-81
  参考文献  79-81
在读期间发表文章与申报专利情况  81-83
个人简历  83-84
致谢  84

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 营养卫生、食品卫生 > 饮食卫生与食品检查 > 食品卫生与检验
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