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重组人胰激肽原酶发酵及复性研究

作　者: 郭平川
导　师: 陈劲春
学　校: 北京化工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 重组人胰激肽原酶包涵体凝胶过滤复性尿素梯度
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

胰激肽原酶（Kallidinogenase, KLK）遍布于人体当中，是人体KKS系统的重要组成成分，能够起到抑制血小板凝聚，改善血液循环和降低血压效果，广泛用于治疗糖尿病，心脑血管，高血压等疾病。本实验重点放在重组人胰激肽原酶的初步发酵优化以及KLK包涵体的变复性工艺。采用单因素的实验方法，研究了影响重组人KLK表达的条件，结果表明：诱导剂IPTG的最适浓度为0.6mmol L^-1；最佳的诱导时间为4h；最佳的Amp的浓度选择为60g L^-1；最佳的培养温度为37℃；最佳的酵母抽提物含量为10g L^-1；最佳的胰蛋白胨含量为18g L^-1。在此条件下，最终可以得到4.62g L^-1的包涵体。对重组KLK工程菌进行IPTG诱导表达，目的蛋白以包涵体形式存在；超声破碎工程菌释放包涵体，经3次洗涤后纯度达到71.93%；包涵体溶于含8M Urea的变性溶液中，浓度可达1731μg mL^-1。进行包涵体稀释复性实验，三个不同的终浓度，181.51μg mL^-1；64.23μg mL^-1；39.14μg mL^-1，酶活分别达到0.85U mg^-1；7.68U mg^-1；11.24U mg^-1。在50μg mL^-1的浓度范围中，酶活最高。一步透析法和多步透析法实验，KLK的终浓度分别达到84.52μg mL^-1，75.42μg mL^-1，酶活达到0.63U mg^-1，3.13U mg^-1。采用柱层析法完成KLK包涵体复性：选用Sephadex-G75进行凝胶过滤复性，柱子堵塞，洗脱不稳定，无法完成复性；采用Urea梯度凝胶过滤色谱（Sephadex-G75），优化尿素梯度的长度，在10%，20%，30%梯度长度下，蛋白回收率分别达到64.27%，75.68%，71.26%，酶活达到23.21U mg^-1，48.61U mg^-1，38.27U mg^-1。最优的梯度长度是20%，此条件下得到的酶活高于稀释复性和透析复性的酶活；采用离子交换色谱对KLK复性，酶活较低，但是纯度高，蛋白回收率达到56.23%，可以作为纯化的手段。采用传统复性法和柱复性法，包涵体KLK均可以达到一定的酶活，经比较发现尿素梯度凝胶过滤色谱（Sephadex-G75）具有复性时间短和酶活高等优点，为重组人胰激肽原酶复性提供一种有效的手段。

重组人胰激肽原酶发酵及复性研究

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