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酶法生物合成胸苷和胞苷工艺的研究

作　者: 徐渊
导　师: 应国清
学　校: 浙江工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 酶法胸苷胞苷固定化
分类号: TQ464.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本文利用大肠杆菌中的核苷磷酸化酶酶法合成了胸苷和胞苷,并通过实验条件的优化,得到了较优的酶法生物合成胸苷和胞苷较佳的工艺路线,为今后的工业化大规模生产提供了一定的理论基础,具有重要的现实意义和社会经济价值。首先本文开展了游离细胞法合成胸苷和胞苷的工艺研究。以大肠杆菌中的核苷磷酸化酶为酶源,利用价廉的胞苷和胸腺嘧啶为反应底物来转化生成胸苷。通过考察菌体培养时间、反应时间、pH和温度等因素对转化率的影响,获得较佳的单因素反应条件。并在此基础上,设计了正交试验,确定出了最优的反应工艺。实验证明,20.0ml反应液（胞苷30.0mmol/L,胸腺嘧啶90.0mmol/L,pH为7.05的KOH—KH₂PO₄缓冲液,1.0g的E.coli湿菌体）,在60℃恒温反应5小时,胸苷的转化率可达到27.1%;pH为7.05的反应液,在60℃恒温反应4小时,胞苷可达到的最高转化率为12.3%。然后开展了固定化细胞法合成胸苷的研究,具体研究了细胞固定化材料及制备工艺。通过考察配方比例、钙化交联方法和保存方法等因素对固定化微球强度的影响,确定出了较佳的固定化微球的制备工艺。结果表明,海藻酸钠固定化微球最佳的制备条件:海藻酸钠2.0%,MgO1.4%,菌体10:1体积比混合,2.0%CaCl₂溶液做交联剂,室温静置4小时进行钙化。海藻酸钠固定化微球最佳的保存方法为冰冻保存法。聚乙烯醇固定化微球最佳的制备条件:聚乙烯醇10.0%,海藻酸钠0.8%,菌体3:1体积比混合,质量分数为4.0%的CaCl₂-饱和硼酸溶液作为交联剂,室温静置4小时进行交联。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章文献综述  11-27
  1.1 核苷的概述  11-16
    1.1.1 核苷的理化特性  11-12
    1.1.2 核苷的应用  12-15
      1.1.2.1 在分子生物学和基因克隆中的应用  12
      1.1.2.2 在DNA芯片中的应用  12-13
      1.1.2.3 在食品添加剂方面的应用  13
      1.1.2.4 在医药领域的应用  13-14
      1.1.2.5 在DNA分子组装体中的应用  14-15
    1.1.3 核苷的生产  15-16
      1.1.3.1 化学合成法  15
      1.1.3.2 RNA酶解法  15-16
      1.1.3.3 酶法生物合成法  16
  1.2 酶法生物合成核苷  16-23
    1.2.1 核苷磷酸化酶的概述  16-19
      1.2.1.1 嘧啶核苷磷酸化酶  17-19
      1.2.1.2 嘌呤核苷磷酸化酶  19
    1.2.2 酶法合成核苷机理  19-20
      1.2.2.1 应用核苷磷酸化酶  19-20
      1.2.2.2 应用N-脱氧核糖转移酶  20
      1.2.2.3 应用酶进行糖或碱基修饰  20
    1.2.3 一些重要核苷的酶法合成  20-21
      1.2.3.1 酶法合成核糖核苷  21
      1.2.3.2 酶法合成核苷  21
      1.2.3.3 酶法合成双脱氧核苷  21
    1.2.4 酶法合成核苷应注意的问题  21-23
      1.2.4.1 菌种的选育  21-22
      1.2.4.2 双酶反应平衡的建立  22
      1.2.4.3 副反应的防止  22
      1.2.4.4 组合技术  22
      1.2.4.5 非水相反应  22-23
  1.3 生物细胞的固定化  23-25
    1.3.1 细胞固定化方法  23
    1.3.2 固定化细胞的载体材料  23-25
      1.3.2.1 有机高分子材料  23-24
      1.3.2.2 无机载体和复合载体  24-25
  1.4 课题的设计思路和研究内容  25-27
第二章游离细胞法合成胸苷和胞苷的工艺研究  27-42
  2.1 前言  27
  2.2 实验仪器与材料  27-28
    2.2.1 实验仪器  27-28
    2.2.2 实验材料  28
  2.3 实验方法  28-33
    2.3.1 游离细胞法合成胸苷的工艺研究  28-31
      2.3.1.1 反应液组成  28-29
      2.3.1.2 菌体的制备  29
      2.3.1.3 单因素试验方法  29-30
      2.3.1.4 正交试验方法  30
      2.3.1.5 胸苷分析测定方法  30-31
    2.3.2 游离细胞法合成胞苷的工艺研究  31-33
      2.3.2.1 反应液组成  31
      2.3.2.2 菌体的制备  31
      2.3.2.3 单因素试验方法  31-32
      2.3.2.4 正交试验方法  32
      2.3.2.5 胞苷分析测定方法  32-33
  2.4 结果与讨论  33-41
    2.4.1 游离细胞法合成胸苷工艺研究的结果与讨论  33-37
      2.4.1.1 菌体培养时间对胸苷酶法合成的影响  33-34
      2.4.1.2 转化反应时间对胸苷酶法合成的影响  34
      2.4.1.3 反应液pH对胸苷酶法合成的影响  34-35
      2.4.1.4 转化反应温度对胸苷酶法合成的影响  35-36
      2.4.1.5 正交试验  36-37
      2.4.1.6 验证试验  37
    2.4.2 游离细胞法合成胞苷工艺研究的结果与讨论  37-41
      2.4.2.1 菌体培养时间对胞苷酶法合成的影响  37-38
      2.4.2.2 转化反应时间对胞苷酶法合成的影响  38-39
      2.4.2.3 反应液pH对胞苷酶法合成的影响  39
      2.4.2.4 转化反应温度对胞苷酶法合成的影响  39-40
      2.4.2.5 正交试验  40-41
      2.4.2.6 验证试验  41
  2.5 小结  41-42
第三章细胞固定材料的研究  42-52
  3.1 前言  42
  3.2 实验仪器与材料  42-43
    3.2.1 实验仪器  42
    3.2.2 实验材料  42-43
  3.3 实验方法  43-45
    3.3.1 海藻酸钠固定的研究  43-45
      3.3.1.1 缓冲液组成  43-44
      3.3.1.2 菌体的制备  44
      3.3.1.3 固定化微球的制备  44
      3.3.1.4 微球强度的测定  44-45
    3.3.2 聚乙烯醇固定的研究  45
      3.3.2.1 反应液组成  45
      3.3.2.2 菌体的制备  45
      3.3.2.3 聚乙烯醇微球的制备  45
      3.3.2.4 微球强度的测定  45
  3.4 结果与讨论  45-51
    3.4.1 海藻酸钠固定研究的结果与讨论  45-48
      3.4.1.1 钙化方法对微球强度的影响  45
      3.4.1.2 微球制备方法改良对强度的影响  45-46
      3.4.1.3 不同磷酸盐缓冲体系对微球强度的影响  46
      3.4.1.4 MgO添加量对微球强度的影响  46-47
      3.4.1.5 保存方法对微球强度的影响  47
      3.4.1.6 降低强度测试温度的微球强度  47-48
      3.4.1.7 海藻酸钠-壳聚糖的微球强度  48
    3.4.2 聚乙烯醇固定研究的结果与讨论  48-51
      3.4.2.1 CaCl2浓度对微球强度的影响  48-49
      3.4.2.2 海藻酸钠含量对微球强度的影响  49-50
      3.4.2.3 保存方法对微球强度的影响  50-51
      3.4.2.4 定性描述聚乙烯醇微球的强度  51
  3.5 小结  51-52
第四章结论与展望  52-53
参考文献  53-58
附录:HPLC图谱  58-61
致谢  61-62
攻读硕士学位期间发表论文情况  62

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