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产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究

作　者: 卢田粉
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 产气荚膜梭菌 α毒素 ε毒素表达免疫保护性
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌(Clostridium perfringens)是引起各种动物肠毒血症，坏死性肠炎和人创伤性气性坏疽的主要病原菌之一。该菌分为A、B、C、D、E5型，其致病因子是菌体产生的外毒素。其中α和ε两种毒素由D型产气荚膜梭菌产生，导致动物致死性肠毒血症，从而造成巨大的经济损失。到目前为止，国内外学者对D型产气荚膜梭菌产生的α和ε毒素的研究还较为少见。因此我们开展了关于这方面的研究，在本研究中，构建能够高效表达 α毒素的重组菌株和ε毒素的重组菌株；然后，分别制备包涵体粗提物，单个免疫以及共同免疫家兔，以此检测其免疫保护性，目的在于有效防控由α和ε毒素引起的牛、羊肠毒血症。首先D型产气荚膜梭菌菌株在厌氧条件下培养复活，提取DNA模板，设计特异性引物，并对其α和ε毒素的部分基因进行PCR扩增、克隆，以常规基因重组技术，将回收的目的基因片段插入到原核表达载体pET-28a中，得到重组质粒，经酶切、测序鉴定后，该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，摸索诱导最优条件，将最佳条件下的诱导产物进行SDS-PAGE电泳，并经镍柱亲和纯化目的蛋白，PBS透析，Western blot检测了蛋白的特异性；将纯化的α和ε毒素蛋白200ug分别混以免疫弗氏佐剂免疫家兔A组和B组，α和ε毒素蛋白各100ug混以免疫弗氏佐剂共同免疫家兔C组，定期取血清并用ELISA方法检测抗体滴度，得到α毒素、ε毒素、α和ε毒素三个抗体消长规律图谱。结果表明，PCR扩增出长度为780bp的产物，通过Blast比对，确认为α毒素基因；PCR扩增出长度为972bp的产物，通过Blast比对，确认为ε毒素基因，表达载体pET-28a和含有目的基因的重组T载体分别双酶切，并将酶切后的线性pET-28a回收产物和酶切后的目的片段回收产物进行连接，成功构建了pET28a-α重组菌株和pET28a-ε重组菌株。表达产物经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳，获得大小分别为28.9KD和36.9KD特异的表达条带，表达量可分别达到32.12%和32.83%，Western blot结果表明表达的目的蛋白具有高度的特异性。以表达的α毒素蛋白的包涵体粗提物和ε毒素蛋白的包涵体粗提物分别作为抗原，二次免疫家兔后，抗血清间接ELISA检测结果显示：经α毒素蛋白免疫的家兔在第4周抗体效价达到最高值为5.7log2；经ε毒素蛋白免疫的家兔在第4周抗体效价达到最高值8.7log2；经α和ε毒素蛋白共同免疫的家兔在第6周抗体效价达到最大值为4.7log2。本研究的结论：构建的两株重组菌株BL21(DE3)能分别高效表达α和ε毒素，而且该毒素具有较高的免疫保护性，单个的免疫家兔，效果比较好，共同免疫家兔也获得了一定的效价水平。该研究为进一步研制肠出血症的双价基因工程苗提供理论依据和支持。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-33
  1.1 产气荚膜梭菌简介  13-17
  1.2 产气荚膜梭菌病的流行及防控情况  17-20
  1.3 α毒素的结构与功能  20-24
  1.4 ε毒素的结构和功能  24-27
  1.5 α和ε毒素的国内外研究进展  27-29
  1.6 本研究的目的和意义  29-32
  1.7 本研究技术路线  32-33
2 材料与方法  33-45
  2.1 材料  33-37
    2.1.1 菌株  33
    2.1.2 实验动物  33
    2.1.3 主要仪器试剂及来源  33-35
    2.1.4 主要试剂的配置  35-37
      2.1.4.1 EB 溶液的配制  35-36
      2.1.4.2 电泳缓冲液（50×TAE）  36
      2.1.4.3 1.0%琼脂糖凝胶的配置  36
      2.1.4.4 产毒素培养基——Gordon 汤  36
      2.1.4.5 Gill 苏木素配制  36
      2.1.4.6 1%伊红酒精溶液配制  36
      2.1.4.7 0.3%过氧甲醇  36
      2.1.4.8 0.05% Tween-20  36
      2.1.4.9 0.01M 柠檬酸盐缓冲液（1000ml 配制）  36
      2.1.4.10 5%BSA（牛血清蛋白）  36
      2.1.4.11 不同浓度一抗、二抗  36
      2.1.4.12 0.01MPBS(1000ml 配制)  36-37
  2.2 试验方法  37-45
    2.2.1 产气荚膜梭菌α和ε毒素基因的表达  37-44
      2.2.1.1 菌种复活及模板制备  37
      2.2.1.2 α和ε毒素基因的克隆及核苷酸序列测定  37-40
      2.2.1.3 α和ε毒素基因表达载体的构建  40-42
      2.2.1.4 α和ε毒素蛋白的诱导表达与纯化  42-43
      2.2.1.5 表达蛋白的 Western blot 检测  43-44
      2.2.1.6 蛋白表达含量的测定及菌株毒性的测定  44
    2.2.2 产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白免疫保护性的研究  44-45
      2.2.2.1 包涵体粗提物的制备  44
      2.2.2.2 实验动物及处理  44-45
      2.2.2.3 免疫程序  45
      2.2.2.4 ELISA 测定抗体消长规律  45
3 结果与分析  45-52
  3.1 α和ε毒素保护性抗原基因的 PCR 扩增，克隆，序列分析  45-47
    3.1.1 α毒素基因的 PCR 扩增、克隆、序列分析  45-46
    3.1.2 ε毒素基因的 PCR 扩增、克隆、序列分析  46-47
  3.2 α毒素和ε毒素基因表达载体的构建  47
  3.3 α和ε毒素蛋白的高效诱导表达与纯化结果  47-50
    3.3.1 α毒素蛋白的高效诱导表达与纯化结果  47-48
    3.3.2 ε毒素蛋白的高效诱导表达与纯化结果  48-49
    3.3.3 Western blot 结果  49-50
  3.4 重组菌株毒性的测定结果  50
  3.5 α毒素抗体效价ELISA测定结果  50-51
  3.6 ε毒素抗体效价 ELISA 测定结果  51
  3.7 α和ε毒素抗体效价 ELISA 测定结果  51-52
4 讨论  52-53
  4.1 产气荚膜梭菌病的流行情况和研制疫苗的必要性  52-53
  4.2 α和ε毒素蛋白的高效表达  53
  4.3 α和ε毒素蛋白免疫保护性的初步研究  53
5 结论  53-55
参考文献  55-64
致谢  64-65
攻读学位期间发表论文及奖励  65

产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究

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