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百日咳鲍特氏菌分子鉴定、基因组多态性与微进化的研究

作　者: 徐颖华
导　师: 杨瑞馥; 张庶民
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 百日咳鲍特氏菌实时PCR MLVA MLST 全基因组 SNP 微进化
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

百日咳是由百日咳鲍特氏菌引起的一种急性呼吸道传染病,传染性较强,人群普遍易感,其中尤以婴幼儿多见。尽管现在世界上绝大多数国家实施百日咳疫苗的免疫接种多年,但百日咳仍是目前疫苗可预防之疾病中死亡病例的主要原因之一。即便是在疫苗接种覆盖率很高的发达国家,近年来百日咳发病率也有上升的趋势,值得特别注意的是,已接种疫苗的青少年和成人患百日咳的人数逐渐增多,但他们的症状并不典型,临床上极易误诊,而且研究表明这些人往往是婴幼儿百日咳的重要传染源,因此,百日咳的研究越来越引起人们的重视。本课题通过研究建立检测和鉴别百日咳鲍特氏菌的多重实时PCR方法;应用多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)和多位点序列分型(MLST)方法分析中国不同时期收集的百日咳鲍特氏菌分离菌株和疫苗株,了解在我国实施百日咳疫苗免疫接种半个世纪以来,流行菌株的基因特征;同时对我国无细胞百日咳疫苗株CS株和现在流行菌株进行全基因组序列测定,在全基因组水平分析菌株之间的差异位点,并以此为基础分析不同来源和不同时期的菌株基因组的单核苷酸多态性(SNP)和插入或缺失(indel)位点的分布,探讨细菌分子进化机制。多重实时PCR检测百日咳鲍特氏菌方法的研究成功建立了检测和鉴定百日咳鲍特氏菌多重实时PCR方法,在同一个反应体系中,能同时扩增3个靶基因,即百日咳鲍特氏菌的百日咳毒素基因启动子区域(ptxP)和插入序列(IS)481序列,副百日咳鲍特氏菌的IS1001序列。通过与针对各靶基因的单道实时PCR方法进行平行检测比较,显示多重PCR系统中各种靶基因的灵敏度并没有发生改变,即在一个反应多重实时PCR反应中,检测百日咳鲍特氏菌最低限为1-5 CFU,副百日咳鲍特氏菌为1 CFU。多重实时PCR系统中各种靶基因重复性试验结果显示批内和批间变异系数均低于7%,表明建立的检测方法具有良好的重复性。由于在多重PCR系统中设定了ptxP和IS481两个靶基因在同一反应体系中检测分析百日咳鲍特氏菌,改善了方法的特异性,提高了检测结果的准确性。应用本研究建立的多重实时PCR方法检测分析以前分离保存的百日咳鲍特氏菌DNA样品,进一步从分子水平确认这些百日咳杆菌菌株,为下一步百日咳鲍特氏菌基因组多态性分析的研究对象提供技术保障。中国百日咳鲍特氏菌分离菌株基因组多态性研究本实验以百日咳鲍特氏菌中两种重要的表面蛋白基因Prn和tcfA以及百日咳毒素基因的上游启动子区域(ptxP)为分子marker,对1950-2007年期间在中国分离的115株菌株和3株疫苗株基因组的多位点序列进行分析,共发现12种MLST型,在不同时期分离菌株中,均以MLST-1/1/2型(Prn/ptxP/tcfA)为主,其中两种疫苗株(CS和P3S10株)也属于MLST-1/1/2型,而另一株疫苗株18530为MLST-1/2/2型。提示在中国目前主要流行菌株的MLST型与疫苗株相似。在中国2000年才发现MLST-2/3/2型菌株,且出现频率较低(19.04%)。基于MLVA分析将115株百日咳鲍特氏菌菌株和3株疫苗株分成了46个不同的MLVA型,其中发现13种新的MLVA型菌株。在中国不同的时期流行着以不同MLVA型为主的菌株;主要流行MLVA型为MLVA-N1、95和33型。与未实施疫苗免疫接种或免疫接种初期的菌株相比较,MLVA实验结果表明在中国免疫接种百日咳疫苗50多年后,菌株基因多态性并没有发生显著性的改变。这些分析结果证实在中国当前流行的百日咳鲍特氏菌菌株与其他实施疫苗免疫接种多年和免疫接种覆盖率高的欧洲国家不同。此外,通过比较MLVA、MLST和PFGE三种分型方法的多态性指数,统计学分析结果表明MLVA分型方法具有最好的分辨率。通过对中国不同时期百日咳杆菌菌株的MLVA和MLST分析,掌握了我国百日咳分子流行病学的第一手资料,对我国有效预防和控制百日咳的流行以及制定新的百日咳疫苗免疫策略具有指导意义。无细胞百日咳疫苗株CS的全基因组序列测定及分析联合应用焦磷酸和Sanger测序技术方法对我国无细胞百日咳疫苗生产株CS进行全基因组序列测定,结果显示该菌株基因组由一条环形染色体组成,其长度为4,124,236 bp,G+C含量为67.73%,编码基因(CDS)为3,456个,假基因数量357个,平均基因大小为982 bp,编码产物大约含有327个氨基酸。与已发表的日本分离菌株Tohama I比较基因组学分析结果表明,CS菌株的全基因组序列较Tohama I(4,086,189 bp)大38,047 bp,在CS全基因组中含有两个特有基因岛,即基因岛CS-1(22,578 bp)和基因岛CS-2(16,690 bp),两株细菌的CDS同源性高达99.53%。我们校正了Tohama I菌株全基因组序列中存在25个SNP和10个indel位点测序错误,CS与Tohama I菌株基因组之间存在301个SNP和40个较小的indel。基于这些比较基因组学分析结果,估算了百日咳鲍特氏菌基因组的SNP丰度为每13,701个碱基含有1个SNP,表明百日咳鲍特氏菌为最保守的单形细菌之一。将两株细菌基因组中插入序列和假基因的数量及其分布的对比分析,进一步证实插入序列在假基因形成以及维持细菌基因组多态性的作用。与其他鲍特氏菌属中已完成全基因组测序的支气管炎鲍特氏菌、副百日咳鲍特氏菌、Bordetella avium和Bordetella petri的比较基因组学分析,鉴定出五种细菌(共6株菌株)全基因组中具有同源性的核心基因1,785个,通过对鲍特氏菌属的核心基因中进行PAML分析,结果显示仅有不到1%的基因的可能受到正选择的影响,表明正选择可能对百日咳分子进化影响较少。这些资料对于进一步研究百日咳鲍特氏菌及其他鲍特氏菌的分子进化奠定基础。百日咳鲍特氏菌的微进化研究通过检测分析CS和Tohama I菌株之间差异位点在七株不同时期分离于中国和日本菌株中的分布,发现新的131个SNP和8个indel。以支气管炎鲍特氏菌中SNP位点碱基为参考,对比分析百日咳杆菌菌株SNP位点发生突变的碱基,发现在百日咳鲍特氏菌基因组中SNP的突变具有GC碱基偏见性。通过SNP的相容性矩阵模型分析表明在百日咳鲍特氏菌核心基因内不相容性低,泛基因中不相容性相对较高,提示在泛基因中,可能受到重组或重复突变导致核苷酸位点发生变化,从而在细菌适应中发挥重要作用,这也可能是百日咳鲍特氏菌一种重要的分子进化机制。BP284的重测序分析结果显示,目前在中国流行菌株基因组中并没有获得新的基因,可能以积累SNP的改变在细菌适应性进化过程中起重要作用。系统发育分析结果显示现阶段中国的流行菌株与上世纪50年代分离菌株有较大的进化距离,位于两个疫苗菌株的外部,其基因组上的改变不仅仅是疫苗压力造成的适应进化,而是进化分支上的根本改变。详细分析各菌株基因组中indel事件,建议indel与菌株来源存在有一定相关性的,并发现各菌株发生indel事件分布与基于SNP分析系统发育进化树分析结果相一致。这些结果有利于我们进一步认识百日咳鲍特氏菌全基因组水平上的微进化,同时也为改进百日咳疫苗提供了新的思路。

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
缩略词表  13-14
前言  14-18
第一章多重实时PCR 检测百日咳鲍特氏菌方法的研究  18-32
  1 导论  18-19
  2 材料和方法  19-24
  3 结果  24-28
    3.1 多重与单道实时PCR 方法检测灵敏度的比较分析  24
    3.2 多重实时PCR 检测方法特异性分析  24-27
    3.3 多重实时PCR 检测方法重复性分析  27
    3.4 初步应用  27-28
  4 讨论  28-31
  5 小结  31-32
第二章中国百日咳鲍特氏菌分离菌株基因组多态性研究  32-56
  1 导论  32-33
  2 材料和方法  33-39
  3 结果  39-51
    3.1 百日咳鲍特氏菌的多位点序列分析  39-45
    3.2 百日咳鲍特氏菌的MLVA 分析  45-51
  4 讨论  51-55
  5 小结  55-56
第三章无细胞百日咳疫苗株CS 的全基因组序列测定及分析  56-74
  1 导论  56
  2 材料和方法  56-60
  3 结果  60-70
    3.1.CS 菌株全基因组完成图的绘制  60
    3.2.CS 菌株基因组的基本特征  60
    3.3.CS 与Tohama I 菌株比较基因组学分析  60-65
    3.4 与鲍特氏菌属其他细菌比较基因组学分析  65-69
    3.5 最大似然法进行系统发育分析  69-70
  4 讨论  70-73
  5 小结  73-74
第四章百日咳鲍特氏菌的微进化研究  74-96
  1 导论  74
  2 材料和方法  74-78
  3 结果  78-92
    3.1.S NP 的一般特性分析  78
    3.2.S NP 碱基突变的偏见性  78-79
    3.3.S NP 位点的相容性矩阵分析  79-80
    3.4 基于SNP 位点的菌株系统发育进化分析  80-81
    3.5.BP284 的重测序结果分析  81-83
    3.6.BP284 菌株的系统发育进化分析  83-89
    3.7. Indel 分析  89-92
  4 讨论  92-95
  5 小结  95-96
参考文献  96-105
附录  105-119
  附表1.本研究各株百日咳鲍特氏菌基因组中indel 相关信息  105-108
  附表2.本研究各株百日咳鲍特氏菌基因组中SNP 相关信息  108-119
论文综述  119-137
  参考文献  132-137
个人简历  137-138
致谢  138

百日咳鲍特氏菌分子鉴定、基因组多态性与微进化的研究

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