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IL-17/IL-17R通路在炎症性肠病中的免疫调节机制研究

作　者: 郭小芹
导　师: 黎燕
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 白细胞介素17 炎症性肠病 免疫调节
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景：炎症性肠病(Inflammatory Bowel Diseases, IBD)是一种病因尚不明确的慢性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s Diseases, CD)两种。IBD在西方国家相当常见,患病率达100-200/10万。近10年,我国炎症性肠病的发病率上升大约10-20倍。鉴于IBD严重危害患者的健康且发生恶变的概率明显高于正常人,该类疾病越来越受到人们的关注。在发病机制上目前认为IBD是由环境、遗传、感染及免疫等多因素相互作用所致,已知肠道粘膜免疫系统异常所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用。最初认为CD4+Th1/Th2细胞亚群的失衡与CD和UC的发生密切相关。近年来一种新型CD4+T细胞亚群Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17在炎症性肠病中的作用逐渐被研究者所关注。如IBD的临床病例显示,UC和CD病人结肠粘膜组织IL-17分泌细胞的水平明显高于正常；IBD病人外周血中IL-17的含量也明显升高,这提示IL-17可能在IBD的发病过程中发挥病理性作用。随后众多的研究探讨了IL-17作为IBD干预靶点的可行性。然而后来的研究发现利用IL-17的单抗对IBD进行临床治疗并未取得预期的治疗效果,这提示IL-17在炎症性肠病中具有复杂的作用,要干预IL-17在IBD中的病理性作用仍需要对其作用机制进行深入的探讨。已知IL-17可通过活化MAPKp38等通路诱导中性粒细胞的聚集等机制促进炎症反应。Act1(activator of NF-k B)是IL-17信号通路中一种重要的接头蛋白,参与了IL-17诱导的MAPK通路分子的活化。但在炎症性肠病中,Actl分子是否以及如何参与IL-17介导的肠上皮细胞的活化,其机制如何等是目前尚不十分清楚的课题。另一方面,也有资料显示IL-17能在炎症性肠病中发挥保护作用。我们前期的研究也发现UC中IL-17的表达升高,而Thl细胞的活性显著降低,IL-17是否通过抑制Thl细胞的活性发挥免疫保护作用,其机制如何是目前尚不清楚而又非常值得探讨的内容。因此,深入认识IL-17介导免疫调节作用的机制将为以IL-17为靶点的炎症性肠病的免疫干预策略提供理论及实验依据。目的：鉴于结肠上皮细胞(Colonic Epithelia Cell, CEC)是IBD累及的主要靶细胞,且是重要的局部免疫反应介导细胞。因此我们以CEC为对象,研究IL-17在CEC中的效应及信号转导机制,探讨IL-17在肠道介导双重作用的分子机制,从而为基于IL-17的临床疾病干预提供理论及实验依据。方法及结果：1.我们首先以CEC细胞系HT-29细胞为模型,通过real-time PCR及Western Blot方法探讨了IL-17促进HT-29细胞活化介导促炎因子表达的细胞内信号转导机制。我们的结果表明,IL-17对HT-29细胞的单独作用不明显,而可以促进TNF-a介导的细胞活化。具体的结果包括：1)IL-17可明显促进TNF-a诱导的多种中性粒细胞趋化因子(CXCL1、2、5、6、IL-8)及Th17细胞趋化因子(CCL20)的基因表达,同时IL-17与TNF-a在P38、ERK和AKT磷酸化水平具有明显的协同效应；2)利用相应的激酶抑制剂证实P38通路是IL-17对TNF-a诱导的IL-8基因表达发挥协同作用的分子机制；3)利用shRNA建立了Actl低表达的稳定细胞系,从基因和蛋白水平均证实具有明显的敲低效果。利用Actl敲低细胞株进一步证实Actl依赖的P38通路是IL-17发挥促炎作用的重要分子机制。2.相对于IL-17的促炎作用,IL-17在自身免疫病中发挥免疫调节作用的报道还非常少,而且机制远不清楚。鉴于我们前期的研究提示IL-17可能通过抑制Thl细胞的活性发挥免疫保护作用,因此本研究重点探讨了IL-17在HT-29细胞是否通过活化不同的细胞内信号转导通路抑制了Thl细胞相关炎症因子的表达。本研究的第二部分将按照发现现象---探讨机制---体内验证三步来阐明并回答这些问题。具体的研究内容及结果包括：1)首先通过口服DSS水建立小鼠溃疡性结肠炎模型,利用real-time PCR方法检测小鼠脾脏、肠系膜淋巴结和结肠固有层淋巴组织中IL-17和IFN-γ的基因表达水平,结果表明,无论在外周还是在局部免疫组织DSS肠炎小鼠中均出现IL-17基因表达水平明显增加,而IFN-γ水平显著下降或有下降趋势,这与我们前期探讨免疫调控分子Tim-3与Th细胞亚群异常关系的研究结果一致(见我们已经发表的文章),提示IL-17在IBD小鼠体内可能对Thl细胞的活性有抑制作用,但其机制仍不清楚；2)本研究中我们同时关注了上述组织中与Thl细胞趋化和分化相关的两种细胞因子(CXCL11和IL-12)的表达情况,结果表明,在DSS肠炎中这两种细胞因子的表达水平均明显下降。这些结果进一步提示在DSS肠炎中高水平的IL-17可能通过影响Thl细胞的分化和趋化而抑制Thl细胞的功能,从而出现IL-17水平升高而IFN-γ水平降低的现象；3)随后我们以结肠上皮细胞系HT-29细胞作为研究对象,利用real-time PCR方法探讨IL-17靶向肠上皮细胞后CXCL11和IL-12等与Thl细胞活性相关的细胞因子／趋化因子的表达变化,发现IL-17能显著抑制TNF-a介导的CXCL11和IL-12P35的基因表达,提示IL-17可能通过抑制Thl细胞的趋化和分化从而负调控Thl细胞功能发挥抗炎作用。在随后的机制研究中我们通过Western Blot、 shRNA、表达谱芯片等技术探讨了IL-17在HT-29细胞介导免疫调节作用(抑制Thl细胞活性)的细胞内信号转导机制。主要的结果包括：①IL-17能协同增强TNF-a诱导的ERK-C/EBPβ和AKT磷酸化水平,利用相应的激酶抑制剂进一步证实这种信号水平的协同是IL-17负调控CXCL11和IL-12P35基因表达的重要分子机制；②用shRNA敲低Actl表达后IL-17对TNF-a诱导的ERK和AKT磷酸化水平未见明显协同效应,同时,IL-17不能抑制TNF-a诱导的CXCL11和IL-12P35基因的表达。这些结果证实Actl依赖的ERK和PI3K-AKT通路是IL-17发挥负调控作用的重要机制；③利用基因芯片技术对Act1敲低后HT-29细胞的表达谱进行了分析,发现Actl敲低后与PI3K-AKT通路密切相关的基因PI3K-CG (PI3KIB亚单位)的表达水平显著降低,同时IL-17促进PI3K-CG基因表达的作用也显著减弱。这些结果提示IL-17可能通过Actl依赖的方式促进PI3K-CG的表达从而影响PI3K I B-AKT通路的活性；4)最后,为进一步证实IL-17靶向肠上皮细胞抑制IL-12基因的表达而负调控Thl细胞的分化,我们模拟体内环境进行了HT-29细胞与PBMC共孵育。结果表明,IL-17可通过抑制肠上皮细胞IL-12基因的表达而负调控Thl细胞的分化及功能；5)为了进一步在体内验证IL-17是否通过抑制CEC中Thl相关炎症介质的表达发挥免疫调节作用,我们进行了如下的实验：①DSS肠炎小鼠在建模后1、3、5、7天经腹腔注射IL-17单克隆抗体,结果显示IL-17抗体阻断后DSS炎症反应明显加重,同时肠上皮细胞中CXCL1、IL-12P35及IFN-γ的表达水平均显著升高,从而表明IL-17抗体阻断后影响了CEC的功能,增强Thl细胞活性,从而加重了DSS肠炎；②为了进一步验证CEC在IL-17介导免疫调节中的关键作用,我们将DSS肠炎来源的肠上皮细胞经腹腔注射到DSS模型小鼠体内后发现,DSS来源的肠上皮细胞能明显加重肠道炎症反应,伴随CXCL1、IL-12P35及IFN-γ等炎症介质表达的升高,而同时给予重组IL-17蛋白能显著逆转CEC的上述病理作用。体内试验的结果进一步证实了IL-17-肠上皮细胞-Thl细胞轴的免疫调控机制。结论：我们的上述研究较为系统地阐述了IL-17在炎症性肠病中的免疫调节机制。一方面我们发现IL-17作用于肠上皮细胞后能通过Act1依赖的MAPK-p38活化通路稳定多种趋化因子的转录后mRNA,从而促进以中性粒细胞浸润为主的局部炎症反应；另一方面IL-17则又能通过Actl-PI3K I B-AKT和Actl-ERK-C/EBPβ两条相对独立的信号通路抑制TNF-a诱导的CXCL11和IL-12P35基因的表达,从而负调控Th1细胞的功能。本研究通过对IL-17双向调控机制的深入探讨,进一步解释了靶向IL-17的炎症性肠病干预为何没有取得预期的效果。同时本研究也为其它具有类似免疫调控功能的分子研究提供了有价值的参考,即炎症介质的作用受时空等微环境因素的影响可能是动态可变的。进一步阐明IL-17介导不同免疫调控作用的分子机制可望为IL-17为靶点的炎性肠病特异性干预提供更为精确的依据。

全文目录


缩略词表  5-8
摘要  8-12
ABSTRACT  12-17
前言  17-19
第一部分 IL-17在肠上皮细胞中发挥促炎机制的研究  19-39
  一 材料与方法  19-26
  二 结果  26-36
  三 小结  36-37
  四 讨论  37-39
第二部分 IL-17在炎症性肠病中对Th1细胞活性的影响及其机制研究  39-77
  一 DSS肠炎中T细胞亚群功能的异常改变  39-48
    (一) 材料与方法  39-42
    (二) 结果  42-47
    (三) 小结  47-48
  二 IL-17靶向肠上皮细胞抑制Th1细胞活性的分子机制  48-62
    (一) 材料与方法  48-51
    (二) 结果  51-61
    (三) 小结  61-62
  三 IL-17体内干预对Th1细胞活性的影响  62-71
    (一) 材料与方法  62-64
    (二) 结果  64-70
    (三) 小结  70-71
  四 讨论  71-77
结论  77-81
参考文献  81-89
综述  89-101
  参考文献  98-101
发表论文  101-113
致谢  113-115
个人简历  115-116

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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