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分子伴侣与信号肽对分泌蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响研究

作　者: 杜济良
导　师: 刘志敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 分子伴侣翻译共转运信号肽 EXG1 表达水平巴斯德毕赤酵母
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

巴斯德毕赤酵母表达系统是一种得到广泛应用的蛋白质表达工具,其相对较高的表达水平,日臻成熟的发酵工艺以及易于操作的蛋白质纯化工艺等特点,使其成为现代蛋白质基因工程药物表达的首选工程菌。但是,随着新的外源蛋白在酵母系统中的表达,该系统也逐渐暴露出了一些潜在的问题,譬如某些蛋白质表达水平下降,产物活性降低或无活性以及新生多肽连在内质网腔中出现聚集沉淀等,这些问题越来越严重的阻碍了酵母系统的推广应用。因此,有必要阐明蛋白质在酵母细胞中的翻译、转运、折叠和分泌的过程,及其可能涉及到的重要影响因素,以期待对目前酵母表达系统所存在的问题提出解决方案。众所周知,信号肽和分子伴侣在蛋白质合成转运过程中发挥着不可替代的重要作用。其中,信号肽是蛋白质分泌转运过程中引导新生肽转移到内质网腔膜上的信号肽识别蛋白,并引导蛋白质分子分泌到特定位置的一段氨基酸序列,因此信号肽作用于蛋白质新生肽转运的整个过程中。而分子伴侣是存在于蛋白质合成分泌整个过程中的一大类辅助分子,参与了新生多肽的转运、折叠与去折叠、错误折叠蛋白的解聚或降解等过程,因此分子伴侣能够保证目的产物的正常构象和生物活性。本课题以分子伴侣和信号肽为研究对象,研究的特点在于完整的考虑不同细胞定位的多种对蛋白质分泌有重要影响的分子伴侣的作用,并将分子伴侣与信号肽这两种对外源蛋白在酵母表达过程中具有重要影响作用的因素联系起来,期望通过研究分子伴侣之间的相互作用,以及分子伴侣与信号肽之间的相互作用,明确分子伴侣与信号肽在蛋白质合成过程中的作用机制的细节,并提出可行的表达水平提高方案的方向。我们选择了胞外-β-(1,3)-葡聚糖酶(EXG1)作为该研究的报告蛋白,它是巴斯德毕赤酵母的一种内源性酶。根据细胞质、内质网膜及内质网腔的分子伴侣对不同信号肽的EXG1在巴斯德毕赤酵母GS115和GS200中表达的影响,研究分子伴侣及蛋白质分泌信号肽对外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的优化表达策略。实验的技术路线如下,首先,通过融合PCR方法将翻译后转运信号肽αMF和αpre,以及翻译共转运信号肽Bip片段分别连接到报告蛋白EXG1成熟肽部分的N端,然后构建出含有不同信号肽报告蛋白的表达载体EXG1/αMF-pPIC9,EXG1/αpre -pPIC9,EXG1/Bip-pPIC9和EXG1-pPIC9。同时,将分子伴侣基因及其组合构建到质粒pBLArg-IX中。此后,将不同信号肽的含有EXG1基因的表达框在毕赤酵母GS115(His-)中表达,然后再将不同细胞定位的分子伴侣分别与(或)组合表达载体与不同信号肽的EXG1在毕赤酵母宿主菌GS200(表型His-/Arg-)内共表达。用0.5%甲醇诱导EX1在摇瓶中表达,通过测定EXG1酶活性以评价分子伴侣与信号肽对其表达水平的影响。结果发现,一方面不同信号对EXG1的表达水平影响明显,其中翻译共转运信号肽EXG1/Bip的表达水平是相对于自身信号肽EXG1的2倍,但是该水平仍低于翻译后转运信号肽EXG1/αMF和EXG1/αpre。另一方面,细胞质及内质网膜上的分子伴侣sec61α、sec61β以及胞质中的分子伴侣Ydj1、Ssa1、Hsp104及其组合对各种信号肽EXG1的表达水平影响不明显,内质网腔分子伴侣Bip,Ero1,PDI与Hac1组合能够明显提高EXG1的表达水平,其中使αMF和αpre信号肽EXG1表达水平提高了2.6-3.8倍,使EXG1-Bip表达水平提高了20-45%,而对自身信号肽EXG1表达水平无影响。以上结果说明,在酵母细胞中,共转运信号肽能够提高报告蛋白EXG1的表达水平,同时内质网中的分子伴侣是胞外-β-(1,3)-葡聚糖酶表达水平的重要影响因素,Bip和Ero1能够在信使分子Hac1的作用下明显提高EXG1/αMF和EXG1/αpre的分泌量,并且能够在一定程度上提高EXG1/Bip的分泌水平。但是尚未发现分子伴侣对信号肽具有优先选择性。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章前言  10-18
  1.1 研究概述  10-12
    1.1.1 酵母表达系统的研究进展  10-12
    1.1.2 酵母表达系统存在的问题  12
  1.2 影响酵母表达系统的因素  12-16
    1.2.1 分子伴侣对酵母酵母表达系统的影响  13-15
    1.2.2 信号肽对酵母表达系统的影响研究进展  15-16
  1.3 EXG1 的结构及生物活性特征  16-18
第二章实验材料  18-24
  2.1 材料  18-21
    2.1.1 菌株  18
    2.1.2 质粒  18
    2.1.3 限制性内切酶及工具酶  18
    2.1.4 试剂盒  18
    2.1.5 核酸及蛋白分子量标准  18
    2.1.6 引物  18-20
    2.1.7 主要仪器  20-21
  2.2 试剂  21-24
    2.2.1 主要试剂  21
    2.2.2 主要培养基  21-22
    2.2.3 主要溶液  22-24
第三章实验步骤  24-44
  3.1 不同信号肽报告蛋白EXG1 基因的克隆  24-27
    3.1.1 自身信号肽EXG1 基因的克隆  24
    3.1.2 EXG1/αMF 基因的克隆  24-25
    3.1.3 EXG1/αPre 基因的克隆  25
    3.1.4 EXG1/Bip 基因的克隆  25-27
  3.2 分子伴侣基因的克隆  27-33
    3.2.1 细胞质分子伴侣基因的克隆  27-29
      3.2.1.1 Ydj1 基因的克隆  27-28
      3.2.1.2 Hsp104 基因的克隆  28
      3.2.1.3 Ssa1 基因的克隆  28-29
    3.2.2 内质网膜分子伴侣基因的克隆  29-30
      3.2.2.1 Sec61α基因的克隆  29-30
      3.2.2.2 Sec61β基因的克隆  30
    3.2.3 内质网腔分子伴侣基因的克隆  30-32
      3.2.3.1 Bip 基因的克隆  30-31
      3.2.3.2 E101 基因的克隆  31-32
      3.2.3.3 PDI 基因的克隆  32
    3.2.4 Hac1 基因的克隆  32-33
    3.2.5 组成型启动子GAP 基因的克隆  33
  3.3 不同信号肽报告蛋白表达质粒的构建  33-37
    3.3.1 EXG1-pPIC9 的构建  33-34
    3.3.2 EXG1/αMF-pPIC9 的构建  34-35
    3.3.3 EXG1/αPre-pPIC9 的构建  35-36
    3.3.4 EXG1/Bip-pPIC9 的构建  36-37
  3.4 分子伴侣表达质粒的构建  37-40
    3.4.1 pBLArg-IX 质粒启动子置换  37-38
    3.4.2 单个分子伴侣表达质粒的构建  38-39
    3.4.3 分子伴侣组合表达质粒的构建  39-40
  3.5 表达载体转化酵母表达菌株及目的基因的诱导表达  40-44
    3.5.1 报告蛋白表达载体的线性化  40
    3.5.2 分子伴侣及其组合表达载体线性化  40-41
    3.5.3 巴斯德毕赤酵母GS115（GS200）感受态细胞的制备  41
    3.5.4 电击转化  41-42
      3.5.4.1 报告蛋白表达质粒电击转化GS115  41-42
      3.5.4.2 报告蛋白表达质粒电击转化GS200  42
      3.3.4.3 分子伴侣及其组合表达质粒电击转化报告蛋白-GS200 重组酵母细胞  42
    3.5.5 不同巴斯德毕赤酵母重组菌在摇瓶里的诱导表达  42-44
      3.5.5.1 不同信号肽报告蛋白在GS115 中的诱导表达  42-43
      3.5.5.2 不同信号肽报告蛋白在GS200 中的诱导表达  43-44
第四章实验结果  44-52
  4.1 目的基因的克隆  44-45
    4.1.1 报告蛋白基因的克隆  44
    4.1.2 分子伴侣基因的克隆  44-45
  4.2 不同信号肽报告蛋白表达载体的构建  45
  4.3 分子伴侣表达载体的构建  45-47
  4.4 表达不同信号肽EXG1 的GS115 阳性克隆筛选结果  47
  4.5 表达不同信号肽EXG1 的GS115 生长曲线  47-48
  4.6 在巴斯德毕赤酵母GS115 中的诱导表达  48-49
  4.7 分子伴侣对不同信号肽EXG1 在GS200 中的表达水平影响  49-52
    4.7.1 细胞质分子伴侣对不同信号肽EXG1 表达水平影响  49
    4.7.2 内质网膜分子伴侣对不同信号肽EXG1 表达水平的影响  49-50
    4.7.3 内质网腔分子伴侣对不同信号肽EXG1 表达水平的影响  50-52
第五章讨论  52-56
结论  56-57
参考文献  57-61
综述  61-67
  参考文献  65-67
个人简历  67-69
致谢  69

分子伴侣与信号肽对分泌蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响研究

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