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人EEF1A1-人凝血因子杂合基因座的构建及其在293FT细胞中表达的鉴定

作　者: 刘蓥灿
导　师: 李力; 陈红星
学　校: 陕西师范大学
专　业: 动物学
关键词: 凝血因子Ⅶ 三次连续抓捕杂合基因座 293f细胞表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

人凝血因子Ⅶ在肝脏内合成,是一种参与凝血过程的重要单链糖蛋白。当组织发生破损的时候血液中的组织因子(TF)暴露出来,FⅦ通过与其相结合形成TF-FⅦ复合物而激发外源性凝血途径,同时内源性凝血途径的启动也受到FⅦ的调控。凝血因子Ⅶ在治疗先天性和获得性FⅦ缺乏疾病、带有FⅧ和FⅨ抑制物的血友病、血小板功能性障碍和血小板减少疾病,以及外科及严重意外创伤的止血等方面具有十分广泛的应用。然而,FⅦ属于血浆微量蛋白,在人体内的正常含量只有200～400ng/ml。因此,为了获得FⅦ的高表达以及随后规模化的制备,在本研究中,通过利用连续三次抓捕技术实现了人EEF1A1-人FⅦ杂合基因座的构建,并在293FT细胞中实现了FⅦ的表达,为哺乳动物细胞系表达大载体提供了探索性研究。本研究包括以下2个方面：1.人EEF1A1-人FⅦ杂合基因座的构建以pBR322为骨架,插入通过全基因合成在一起的6个同源臂以及Kana,neo等筛选标记,构建得到pBR322-GAPREPAIR三次连续抓捕载体。通过RED同源重组系统,在E.coli内进行缺口修复,依次在含有人EEF1A1和人FⅦ的BAC上抓捕得到人EEF1A1的3’调控区序列、人FⅦ的基因组、人EEF1A1的5’调控区序列,得到pBR322-5’hEEF1A1-hFVII-3’hEEF1A1重组子.经过PCR扩增.限制性内切酶消化和测序验证,我们得到约50kb的人EEF1A1-人FⅦ杂合基因座,原人EEF1A1基因组编码序列从起始密码子到终止密码子在构建的杂合基因座中被人FⅦ基因组序列精确置换。2.人EEF1A1-人FⅦ杂合基因座在293FT细胞中的表达首先将构建得到的pBR322-5’hEEF1A1-hFⅦ-3’hEEF1A1重组子酶切线性化,电击转染进293f细胞系,通过600mg/ml的G418压力筛选,得到抗性细胞。对通过G418抗性筛选得到的混合细胞克隆进行基因组和mRNA的提取,应用PCR检测目的基因的整合及转录情况,结果表明构建的人EEF1A1-人FⅦ合基因座整合进入了293FT细胞基因组,并且成功转录。随后通过对收集的细胞上清进行ELISA检测后发现,表达产物中有凝血因子Ⅶ的存在。在本研究中,我们成功构建了人EEF1Al-人FⅦ杂合基因座,并在哺乳动物细胞中实现了FⅦ的表达,为今后哺乳动物细胞系表达大载体的研究奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第1章前言  9-13
  1.1 本研究的目的及意义  9
  1.2 人凝血因子Ⅶ的研究进展  9-10
  1.3 哺乳动物细胞表达系统的研究进展  10-11
  1.4 RED同源重组系统在构建表达载体中的应用  11-13
第2章连续三次基因抓捕构建人EEF1A1-人凝血因子Ⅶ杂合基因座  13-29
  2.1 材料  13-15
    2.1.1 载体与质粒  13
    2.1.2 工具酶与试剂盒  13
    2.1.3 引物  13-14
    2.1.4 主要溶液  14
      2.1.4.1 培养基  14
      2.1.4.2 核酸电泳用试剂  14
    2.1.5 碱裂解法提取质粒所用试剂  14-15
    2.1.6 主要仪器  15
  2.2 实验方法  15-21
    2.2.1 接菌  15-16
    2.2.2 转化  16
    2.2.3 质粒提取(东盛试剂盒碱裂解法提取小量细菌质粒DNA)  16-17
    2.2.4 PCR扩增目的片段  17
    2.2.5 凝胶回收（QIAGEN试剂盒）  17-18
    2.2.6 DNA的限制性酶切  18
    2.2.7 DNA片段纯化(TAKARA试剂盒)  18-19
    2.2.8 外源DNA与质粒载体的连接反应  19
    2.2.9 阳性克隆的鉴定  19
    2.2.10 化学感受态细胞的制备(氯化钙法)以及质粒热击转化方法  19-20
    2.2.11 电击感受态细胞的制备以及质粒电击转化的方法  20-21
  2.3 pBR322-gaprepair载体的构建  21-22
  2.4 三步连续基因抓捕过程  22
  2.5 结果  22-25
    2.5.1 pBR322-Gaprepair载体的构建  22-23
    2.5.2 三次连续基因抓捕  23-25
  2.6 测序  25
  2.7 讨论  25-29
第3章 hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座在293FT细胞中表达的研究  29-43
  3.1 材料  29-31
    3.1.1 细胞  29
    3.1.2 主要试剂和溶液  29-30
    3.1.3 主要耗材  30
    3.1.4 仪器  30
    3.1.5 鉴定引物  30-31
  3.2 方法  31-37
    3.2.1 细胞复苏  31
    3.2.2 细胞传代  31-32
    3.2.3 细胞冻存  32
    3.2.4 细胞培养  32
    3.2.5 转染所需DNA质粒的提取(Promega质粒提取试剂盒)  32-33
    3.2.6 细胞转染(核电击转染法)  33
    3.2.7 筛选单克隆  33-34
    3.2.8 细胞总RNA的提取(6孔板)  34
    3.2.9 PCR扩增目的基因  34-35
    3.2.10 ELISA测定hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座表达量  35-37
  3.3 G418抗性对293FT细胞最小致死浓度确定  37
  3.4 结果  37-40
    3.4.1 hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座在293FT细胞中表达的鉴定  37-39
    3.4.2 hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座的ELISA检测结果  39-40
  3.5 讨论  40-43
结论  43-45
参考文献  45-49
附录  49-51
致谢  51-53
攻读硕士学位期间科研成果  53

人EEF1A1-人凝血因子杂合基因座的构建及其在293FT细胞中表达的鉴定

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