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多拷贝甘露聚糖酶基因生物砖表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

作　者: 赵联忠
导　师: 马立新
学　校: 湖北大学
专　业: 分子生物学
关键词: 甘露聚糖酶 生物砖 生物砖载体 基因拷贝数 大肠杆菌BL21(DE3)
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


在生物研究领域,蛋白质表达是一个非常重要内容,研究者往往希望目的蛋白能够有很高效率的表达,从而获得更多目的蛋白,以达到研究的目的。但是,人们总会遇到一些难题,蛋白质很难有效表达,或者表达量达不到要求,因此尝试用各种方法解决上述难题,基于这样的目的,本文在方法学上对实现蛋白质更高更有效表达途径进行探索,基本思路是,通过提高基因拷贝数,来提高目的蛋白表达量,为某些蛋白质表达提供一种可行的表达方式或途径。生物砖组装技术是近几年发展起来的一种快速、高效装配技术,本实验采用生物砖的原理,快速构建多拷贝甘露聚糖酶基因原核表达生物砖载体(pBAD/His-man),然后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,比较在相同的外部条件下,不同拷贝数基因之间蛋白表达量的差异,通过分析这种差异,初步探究基因拷贝数与蛋白表达量之间存在的某种联系。由于原核基因表达本身存在很强的内源调控,因此还需要在诱导剂浓度和诱导时间上进行摸索,消除蛋白饱和表达对实验结果产生强烈的偏差。本实验成功构建了1至6拷贝甘露聚糖酶基因原核表达生物砖载体pBAD/His-man,经过了多次重复实验,结果显示,在诱导时间为四小时时,2至6拷贝的转化子甘露聚糖酶平均表达量无明显差异,而比1拷贝的要高；诱导时间缩短为30分钟时,各拷贝数转化子表达量差异显著,但哪一种拷贝数的表达量最高,还不能确定,主要因为高表达稳定性太差。但是总的来讲,增加拷贝数确实可以一定程度的提高蛋白表达量。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
引言  10-11
第一部分 文献综述  11-20
  1.1 生物砖技术及研究进展  11-14
    1.1.1 生物砖的概念和特点  11
    1.1.2 生物砖研究发展概况  11-12
    1.1.3 生物砖的装配  12-13
    1.1.4 生物砖技术在合成生物学中的应用  13-14
  1.2 大肠杆菌表达系统  14-17
    1.2.1 大肠杆菌表达系统简述  14
    1.2.2 表达载体  14-15
    1.2.3 mRNA的稳定性对蛋白表达的影响  15-16
    1.2.4 蛋白酶对目的蛋白产量的影响  16-17
    1.2.5 大肠杆菌表达的局限性及改进策略  17
  1.3 基因多拷贝策略  17-19
    1.3.1 构建多拷贝基因表达载体的意义  17-18
    1.3.2 多拷贝基因表达载体构建方法  18
    1.3.3 生物砖表达载体串联多拷贝基因的优点  18-19
  1.4 本研究的目的与意义  19-20
第二部分 材料与方法  20-32
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 菌株和质粒  20
    2.1.2 培养基  20
    2.1.3 酶和试剂  20-21
    2.1.4 仪器和设备  21
    2.1.5 主要Buffer  21-22
    2.1.6 PCR引物  22
  2.2 方法  22-32
    2.2.1 SDS-PAGE回收DNA  22-23
    2.2.2 琼脂糖凝胶回收目的DNA片段  23-24
    2.2.3 SDS碱裂解法制备质粒DNA  24-27
    2.2.4 外源基因在E.coli中的表达  27-28
    2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备  28-29
    2.2.6 大肠杆菌的转化  29-30
    2.2.7 SDS-PAGE检测蛋白质的表达  30-32
第三部分 结果与分析  32-47
  3.1 大肠杆菌生物砖载体PBAD/HIS的构建  32-35
  3.2 甘露聚糖酶(mannanase)生物砖表达载体的构建  35-41
    3.2.1 大肠杆菌表达甘露聚糖酶基因的制备  35-36
    3.2.2 生物砖载体pBAD/His的制备  36-37
    3.2.3 1 拷贝甘露聚糖酶基因表达载体的构建  37
    3.2.4 生物砖法构建man基因多拷贝表达载体  37-41
  3.3 PBAD/HIS-MAN在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中的表达  41-47
    3.3.1 诱导4小时不同拷贝数甘露聚糖酶表达量分析  41-44
    3.3.2 诱导1小时不同拷贝数甘露聚糖酶表达量分析  44-45
    3.3.3 诱导30分钟不同拷贝数甘露聚糖酶表达量分析  45-47
第四部分 讨论与展望  47-49
  4.1 讨论  47
  4.2 展望  47-49
参考文献  49-53
致谢  53

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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