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鼠疫耶尔森氏菌毒力相关转录调控子Zur和PhoP的研究

作　者: 李英丽
导　师: 杨瑞馥；周冬生
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 鼠疫耶尔森氏菌 转录调控 比较转录谱学 Zur PhoP
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


鼠疫是一种古老的自然疫源性疾病,其病原菌鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)是多宿主寄生菌,体现在:鼠疫菌以蚤类为传播媒介寄居在特定的宿主(主要是啮齿动物),并在自然界宿主中造成鼠疫疫情的周期性爆发,该过程中偶然与患畜接触或被带菌跳蚤叮咬而感染到人。面对上述的复杂因素,鼠疫菌必须能够感应并快速适应每个环节的变化,才能在宿主体内存活并在自然界中传播最终致病,而每个适应性反应也必然伴随着鼠疫菌基因转录改变,这体现在:很多特定的调控子,分别感应特定的外界信号,介导特定基因(包括毒力基因)表达的上调和下调,最终组成复杂的毒力调控网络,控制鼠疫菌在媒介和贮存宿主中生存能力和致病力。病原菌从感应信号刺激到表达毒力因子的过程中,毒力调控子起着不可替代的作用。广谱或特异性的调控子,控制着毒力基因的表达;另外,若干个毒力调控基因的表达产物可组成一个复杂系统,执行毒力调控的功能,常称作毒力调控系统。一直作为研究热点的细菌毒力调控系统主要有QS系统、二元调控系统、Fur系统等等。这些系统又分成许多子调控系统,控制着不同类型毒力基因的表达,在细菌表现毒力的不同阶段起着调控作用。Zur阻遏蛋白属于Fur家族,可以调控锌离子的转运,锌离子在所有生物细胞中是一种重要的蛋白质功能组分。PhoP-PhoQ是一种二元调控系统(two-component system),可以调控细菌的毒力,参与细菌对Mg2+限制性生长环境的适应,从而有利于鼠疫菌在巨噬细胞内的存活和繁殖。为了鉴定鼠疫菌毒力调控子Zur和PhoP的靶基因,尤其是直接调控的靶基因,并进一步研究Zur和PhoP对其下游直接靶基因的精细调控机制,本研究首先利用基于Red系统的一步法突变技术缺失替换鼠疫菌的zur和phoP基因,进而利用鼠疫菌全基因组DNA芯片进行基因转录谱分析。通过比较突变株和野生株在特定条件下的转录水平差异,界定表达上调和下调的基因,这些基因组成了Zur或PhoP调控元。这一分析可从全基因组水平筛选出所有受Zur或PhoP直接或间接调控的靶基因。转录谱的分析结果可以通过Real time RT-PCR进行验证。凝胶阻滞实验技术的应用,可以鉴定直接调控的靶基因,选择若干关键毒力相关基因,采用DNA酶I足迹实验技术、引物延伸实验技术,深入研究Zur和PhoP是如何直接调控这些基因的转录和表达,将毒力表型和分子实验数据结合起来,认识Zur和PhoP如何通过激活或抑制特定基因的表达,控制着鼠疫菌的宿主适应力和致病力。与野生株相比,敲除了zur基因的鼠疫菌在锌离子刺激下有154个基因发生了转录丰度改变,其中64个基因转录上调,90个基因转录下调。汇总文献预测的Zur结合位点,通过consensus-matrix和convert-matrix程序计算Zur结合序列每个位置四个碱基出现的权重,得到Zur结合序列的Matrix,进而用WebLogo软件展示序列logo,最终预测得到Zur结合box:GAAATGTTATAWTATAACATTTC。基于上述Zur基序分析和Zur调控子的转录谱分析,我们通过Matrix scan程序查找Zur保守基序,选取weight值较高的4个基因ykgM、znuC、znuA、astA进行进一步的分子生化实验。通过凝胶阻滞实验明确了ykgM、znuC、znuA 3个转录单元直接受Zur调控。为了明确Zur的精细调控机制,本研究对这三个转录单元的启动子进行了足迹实验,得到了精确的Zur结合保护区域,在这个区域内存在着预测的Zur box,Zur蛋白直接调控的这三个转录单元,其Zur box均覆盖-10序列,这样就阻碍了RNA聚合酶的结合,可能正因为如此,使Zur表现出对它们的抑制特性。对锌离子刺激下的野生株和?zur突变株同时进行引物延伸实验,不仅可以明确受Zur转录调控的鼠疫菌ykgM、znuC和znuA的转录起始位点,也可以确定Zur对其转录的影响。同时结合足迹实验得到的Zur结合位点,推断出每个启动子内的RNA聚合酶结合位点(-10序列)以及-35序列,丰富了Zur调控元启动子区的分子特性。前期对于?phoP突变株和野生株在低镁条件下的转录谱分析,已经初步界定了PhoP调控元,同样,我们用Real time RT-PCR对转录谱的分析结果进行验证。凝胶阻滞实验确定了30个转录单元直接受PhoP的转录调控,对其中17个基因的启动子区做了足迹实验,得到19个PhoP结合保护区域。通过生物信息学分析将鼠疫菌的PhoP box归纳为TGTTTAW七核苷酸同向重复序列,结合引物延伸实验得到的基因转录起始位点的位置信息,根据鼠疫菌的PhoP box在靶基因启动子内的位置以及是否含有-35序列,我们将PhoP启动子结构特征归纳为三类:PhoP结合位点在-35序列上游;PhoP结合位点覆盖-35序列;PhoP结合位点在-10序列的下游。本研究首次较全面地鉴定了鼠疫菌Zur和PhoP直接调控的调控元,同时从分子水平上明确了鼠疫菌Zur box和PhoP box的特性,探究了Zur和PhoP转录调控机制,为Zur和PhoP这类毒力调控子调控网络的构建,以及这些调控元功能的进一步明确提供了实验证据,这些机制的系统阐述将为鼠疫菌致病机制和疫苗的研究奠定重要基础。

全文目录


摘要  9-11
ABSTRACT  11-14
前言  14-18
  1. 细菌的转录调控子与基因调控  14
  2. 细菌毒力相关的转录调控子  14-15
  3. 鼠疫菌的基因调控研究  15
  4. 转录调控子Zur的研究进展  15-16
  5. 转录调控子PhoP的研究进展  16
  6. 本研究的目的与总体研究计划  16-18
第一部分 鼠疫菌Zur 调控元研究  18-72
  1. 前言  18-19
  2. 材料  19-26
    2.1 菌株与质粒  19
      2.1.1 菌株  19
      2.1.2 质粒  19
    2.2 酶与试剂盒  19
    2.3 试剂、溶液与药品  19-26
    2.4 主要仪器  26
  3. 方法  26-46
    3.1 ⊿zur 突变株的构建  26-28
      3.1.1 突变盒引物的设计与突变盒的扩增  26-27
      3.1.2 感受态细胞制备  27
      3.1.3 电转化  27
      3.1.4 重组克隆的筛选鉴定  27-28
    3.2 鼠疫菌总RNA 的提取  28
      3.2.1 菌体收集和RNA 固定  28
      3.2.2 菌体裂解  28
      3.2.3 沉淀核酸  28
      3.2.4 消化DNA  28
      3.2.5 沉淀RNA  28
    3.3 总RNA 的荧光素标记  28-30
      3.3.1 逆转录生成氨基标记的cDNA  28-29
      3.3.2 氨基标记cDNA 纯化  29-30
      3.3.3 氨基标记cDNA 的荧光素标记与纯化  30
    3.4 芯片杂交及数据分析  30-31
      3.4.1 芯片的紫外交联与醛基封闭  30
      3.4.2 芯片的预杂交  30
      3.4.3 芯片杂交与漂洗  30
      3.4.4 数据分析  30-31
    3.5 Zur 调控元分析  31
    3.6 实时定量逆转录PCR（REAL TIME RT-PCR）  31-35
      3.6.1 Trizol 提取细菌RNA 的方法  31-32
      3.6.2 Ambion’s DNA-freetm kit 去DNA 污染  32
      3.6.3 逆转录  32-33
      3.6.4 Real-time PCR 反应  33-35
    3.7 Zur 蛋白基因的克隆，表达和纯化  35-37
      3.7.1 引物设计及合成  35
      3.7.2 产物的扩增与连接  35-36
      3.7.3 连接产物转化感受态大肠杆菌 BL21（DE3）  36
      3.7.4 阳性克隆的挑选及目的蛋白的表达  36-37
      3.7.5 目的蛋白的纯化  37
    3.8 Zur 结合位点的生物信息学预测  37
    3.9 凝胶阻滞实验（EMSA）  37-40
      3.9.1 目的DNA 片段的合成  37-38
      3.9.2 探针的标记  38-39
      3.9.3 结合百分比的测定  39
      3.9.4 未结合的标记物的去除  39-40
      3.9.5 结合反应  40
    3.10 DNA 酶I 足迹实验（DNASE I FOOTPRINTING ASSAYS）  40-42
      3.10.1 寡核苷酸序列5’平末端标记  40-41
      3.10.2 PCR 及PCR 产物的纯化  41
      3.10.3 结合反应  41-42
      3.10.4 足迹实验  42
    3.11 引物延伸实验（PRIMER EXTENSION ASSAYS）  42-44
      3.11.1 与靶基因m RNA 互补引物的设计  42-43
      3.11.2 总RNA 的提取  43
      3.11.3 寡核苷酸探针的制备  43
      3.11.4 引物延伸反应  43-44
    3.12 测序反应  44-46
      3.12.1 寡核苷酸引物的标记  44
      3.12.2 延伸/终止反应  44-46
  4. 结果与讨论  46-71
    4.1 ⊿zur 突变株的构建  46-47
    4.2 Zur 调控子的转录谱分析  47-55
    4.3 RT-PCR  55
    4.4 Zur 蛋白的表达纯化  55-62
    4.5 Zur 结合序列的基序分析  62-63
    4.6 Zur 结合序列的生物信息学预测  63-64
    4.7 分子生化实验  64-71
      4.7.1 凝胶阻滞实验（EMSA）  64-66
      4.7.2 DNA 酶I 足迹实验  66-69
      4.7.3 引物延伸实验  69-71
  5. 结语  71-72
第二部分 鼠疫菌PhoP 调控元研究  72-105
  1. 前言  72-73
  2. 材料  73
    2.1 菌株与质粒  73
    2.2 酶与试剂盒  73
    2.3 试剂、溶液与药品  73
    2.4 主要仪器  73
  3. 方法  73-74
    3.1 实时定量逆转录PCR  73-74
    3.2 凝胶阻滞实验  74
    3.3 DNA 酶I 足迹实验  74
    3.4 引物延伸实验  74
    3.5 测序反应  74
    3.6 PhoP 结合位点的生物信息学分析  74
  4. 结果与讨论  74-95
    4.1 部分表达谱结果的RT-PCR 验证  74-80
    4.2 分子生化实验  80-95
      4.2.1 凝胶阻滞实验（EMSA）  80-82
      4.2.2 DNA 酶I 足迹实验  82-89
      4.2.3 引物延伸实验  89-95
  5. 结语  95-96
  6. 附录  96-105
参考文献  105-113
锌离子依赖型调控蛋白及其调控元研究（综述）  113-124
简历  124-125
致谢  125

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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