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miRNA在脊髓发育及肿瘤分类中的作用

作　者: 赵建军
导　师: 马旭
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 遗传学
关键词: 小分子RNA 寡核苷酸芯片表达谱脊髓发育神经胶质细胞瘤视网膜母细胞瘤锁定核苷酸原位杂交组织芯片福尔马林固定石蜡包埋
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

microRNA(miRNA)是一种大小约21～23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工而成，在线虫、植物、昆虫和哺乳动物都有发现。近年来，随着对miRNA在生物个体发育过程中的基因表达调控作用的认识，使得miRNA的研究倍受关注，并成为当前生命科学理论和应用研究的热点。在理论方面，重点研究miRNA如何通过参与转录后基因表达的调控，在细胞分化、增殖和死亡、发育调控等方面发挥作用；在应用方面，以miRNA为靶向的小分子RNA药物正在成为生物药物开发新热点，而组织特异性miRNA表达谱有可能成为肿瘤诊断、分级、分类与预后的新标志。一、miRNA在胚胎脊髓发育中作用机制的研究目的：筛选并鉴定胚胎脊髓组织中特异性miRNA，分析其在脊髓神经细胞分化、增殖和发育过程中的基本功能，为深入研究胚胎神经系统正常发育和畸形形成机制提供基础。方法：首先应用寡核苷酸芯片技术分析人12孕周和24孕周流产胎儿不同器官的全基因组miRNA表达谱，通过Northern Blot和聚类分析确定脊髓等中枢神经系统特异性miRNA；通过全反式维甲酸(RA)诱导建立大鼠胚胎脊柱裂动物模型，根据大鼠胚胎发育情况，分别在第13.5、15.5、17.5和19.5天取出胚胎，采用miRNA组织细胞原位杂交和Northern Blot等方法检测脊髓发生过程中miRNA的表达情况，分析脊髓组织特异miRNA在神经细胞分化、增殖和发育中的作用。结果：(1)分别构建了12周和24周人胚心脏、肝、肾、肺、脑、脊髓等组织器官的全基因组miRNA表达谱，结果显示158种人源miRNA的72％-83％在胚胎组织器官中表达，且相同发育阶段的不同组织器官miRNA表达谱不同，而不同发育阶段的相同组织器官，miRNA表达谱也不同；通过聚类分析，首次发现mir-9／9~*仅在人胎儿神经系统中表达，包括大脑和脊髓，以及miR-124a、miR-125b和miR-128等三种与mir-9／9~*协同表达的胚胎神经系统特异miRNA。(2)在RA诱导的脊柱裂大鼠脊髓细胞凋亡明显增加，表明RA处理可诱导胚胎发育晚期脊髓细胞的非正常死亡；Bcl-2与miR-9／9~*以及P53与miR-124a／125b具有相同的时空表达模式；且运动神经元和背根神经节中miR-124a／125b表达缺失。结论：(1)本论文在大脑、脊髓等人胚胎神经系统首次发现了独特的miRNA表达谱，提示miRNA在人胚胎大脑和脊髓发育过程中起重要作用。(2)本论文发现，RA诱导脊髓特异性miRNA表达下调主要为时空表达模式的失调，提示这些miRNA有可能通过RA诱导下调，进而影响脊髓的正常发育或诱导了细胞凋亡；此外，本研究结果还显示miR-9／9~*和miR-124a／125b可能通过调控Bcl-2和P53通路，在感觉和运动神经元发育过程中发挥作用。二、miRNA用于神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤分类研究目的：以神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤为对象，筛选并构建肿瘤组织特异性miRNA表达谱，研究其作为肿瘤分级、分类及预后分子标志的可行性。方法：根据WHO临床分级标准收集新鲜的神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤样本，通过福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)制作组织芯片(TMA)，采用miRNA芯片、组织细胞原位杂交(ISH)和Northern Blot等方法确定肿瘤组织miRNA表达特征，采用免疫组织化学方法检测肿瘤相关蛋白标记，包括Ki-67、VEGF和GFAP等在肿瘤组织的定位与表达情况，通过聚类分析构建肿瘤组织miRNA特异性表达谱。结果：(1)对神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征的研究结果显示，人神经胶质细胞瘤中miR-9和miR-21表达的增加，而miR-124a、miR-125b表达的减少，结合病理诊断，发现组织特异性miRNA表达模式与神经胶质细胞瘤的病理分级相关；此外，miRNA总体表达水平与Ki-67、VEGF以及GFAP标志物之间呈负相关。(2)对视网膜母细胞瘤组织miRNA表达特征研究结果显示，肿瘤组织基因组miRNA整体表达水平高于正常对照，有11种miRNA表达水平超过正常视网膜组织的2倍(N／T＜0.5)，其中表达水平高于正常水平4倍的有miR-373*、miR-503和miR-320；该结果与Northern Blot和组织细胞原位杂交结果一致。结论：(1)根据本论文对神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征的研究结果表明，miRNA是一类不同于现有肿瘤标志物的新型分级、分类标志物，同时结合临床病程、病理诊断以及聚类分析，提示神经胶质细胞瘤组织miRNA表达特征也可用于预后以及放、化疗敏感性或耐药性的判定，并特别提出miR-9、miR-21、miR-124a和miR-125b可能是神经胶质瘤诊断、治疗和预后评估的关键标志物。(2)在对视网膜母细胞瘤组织miRNA表达特征的研究中，首次发现肿瘤基因组miRNA整体表达水平增高，提示视网膜母细胞瘤的发病机制可能与其他实体瘤不同，其中miR-373*、miR-503和miR-320表达水平远高于其他miRNA，提示其可能是在视网膜母细胞瘤发生、发展中起重要作用的调控分子。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-10
第一部分 miRNA在胚胎脊髓发育中作用机制的研究  10-60
  1.1 前言  10-16
  1.2 材料与方法  16-33
  1.3 结果  33-50
  1.4 讨论  50-56
  1.5 结论  56-57
  1.6 参考文献  57-60
第二部分 miRNA用于神经胶质细胞瘤和视网膜母细胞瘤分类研究  60-94
  2.1 前言  60-64
  2.2 材料与方法  64-70
  2.3 结果  70-82
  2.4 讨论  82-89
  2.5 结论  89-90
  2.6 参考文献  90-94
附录  94-109
综述1: miRNA的生物学作用概述  109-127
综述2: miRNA在神经发育和肿瘤发生中的作用  127-139
致谢  139-140
个人简历  140-142

miRNA在脊髓发育及肿瘤分类中的作用

内容摘要

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