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活细胞中GLUT4囊泡转运过程动态分析及转运机制研究

作　者: 许迎科
导　师: 郑筱祥
学　校: 浙江大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 葡萄糖转运蛋白4 GLUT4囊泡 全内反射荧光显微术 活细胞成像
分类号: R587.1
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


糖尿病是一种发病机制复杂的多因素疾病,与多种危险因子包括肥胖、高血压、血脂紊乱和动脉粥样硬化有关,其中胰岛素抵抗是其病理发生的重要原因。研究表明,胰岛素信号通路及GLUT4囊泡的转运障碍在胰岛素抵抗的发生发展中起了关键作用。作为脂肪细胞及骨骼肌细胞中转运葡萄糖的最主要蛋白,GLUT4能够接受胰岛素的刺激而从胞内转运至细胞膜上,但目前对于GLUT4囊泡的胞内动态转运过程及其转运相关的机制还不明确。本课题应用蛋白荧光标记技术、单细胞激光共聚焦与全内反射荧光显微成像及图像定量处理分析等生物医学研究手段,分析了大鼠原代脂肪细胞及C2C12肌细胞中GLUT4囊泡的动态转运过程,研究了胰岛素及细胞骨架对胞内GLUT4囊泡转运的影响及其作用机制,为阐明GLUT4囊泡调控的时空关系,探索糖尿病发生的细胞分子机制打下基础。本研究建立了大鼠原代脂肪细胞的培养及高效率转染的细胞模型。通过组织、细胞形态学及荧光染色的手段研究了脂肪细胞的物理及生化特性。应用电穿孔转染手段,通过摸索优化转染条件实现了原代脂肪细胞的基因高效率导入,为本课题开展的单细胞活体GLUT4囊泡成像奠定了基础。研究了大鼠原代脂肪细胞中GLUT4囊泡转运的动态过程和胰岛素及微管细胞骨架对脂肪细胞中GLUT4囊泡转运的作用及其相关生理机制。结果显示:胰岛素对于GLUT4囊泡转运的调节机制在于提高细胞膜附近单位面积内的GLUT4囊泡数目,减缓GLUT4囊泡的运动,促使更多的GLUT4囊泡与膜锚定及融合;微管蛋白的阻断剂nocodazole可以浓度依赖性的破坏脂肪细胞的微管细胞骨架,完全破坏细胞的微管结构使GLUT4囊泡的长距离运输方式消失,但并未显著减低单位面积内GLUT4囊泡的数目。表明微管细胞骨架对于GLUT4囊泡的长距离运输是必需的,而对于GLUT4囊泡在胞内的分布却是非必需的,微丝细胞骨架在GLUT4囊泡的运输中也许同样发挥作用;发现了GLUT4囊泡的长距离双向运输方式,并对此特殊运输方式进行了定量分析及合理假设。通过对大鼠原代脂肪细胞中GFP标记的IRAP蛋白的动态实时成像,研究了IRAP与GLUT4蛋白的空间定位及转运特性。研究表明:IRAP与内源性的GLUT4蛋白有充分的共定位,与GLUT4类似,外源表达的IRAP也能够响应胰岛素的刺激作用而转运至细胞膜上:在TIRFM下,大多数的IRAP都锚定于细胞膜上或聚集成团,长距离运输的方式非常少见,表明IRAP的过量表达破坏了GLUT4囊泡的运输平衡,显示IRAP可能在GLUT4囊泡转运及胞内定位中发挥作用。探讨了C2C12肌细胞中GLUT4和IRAP蛋白的胞内空间分布及胰岛素与微管细胞骨架对GLUT4囊泡转运的作用及其相关生理机制。结果表明:外源表达的IRAP与细胞中内源性的GLUT4几乎没有共定位,推测GLUT4囊泡的形成与细胞的分化状态有关;胰岛素显著提高了C2C12细胞中GLUT4和IRAP的运动性,而使用nocodazole破坏微管骨架后则显著降低了GLUT4的运动性,阐明了它们在GLUT4囊泡的转运中所发挥的生理作用。综上所述,本课题的研究取得了以下创新性成果:1)通过在大鼠原代脂肪细胞中建立稳定的基因导入体系,开展GLUT4囊泡转运调控的研究,较之使用各种已建的细胞株模型更偏机体真实的生理条件;2)以C2C12细胞为靶细胞,在肌细胞中开展GLUT4囊泡胞内运动的TIRFM成像研究,探究了胰岛素及微管骨架对GLUT4囊泡转运的调节机制;3)在两种胰岛素作用的靶细胞中,使用GFP的GLUT4和IRAP这两种标记系统来标记胞内的GLUT4囊泡,并结合活细胞实时荧光成像技术对GLUT4囊泡在胞内的异质性分布、转运特性、胞吐等相关的动态生物物理现象及胰岛素信号和微管细胞骨架对囊泡的调节等生理问题进行了系统的定量分析讨论,这些研究在国内外未见报道。

全文目录


摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
第一章 绪论  15-45
  1.1 引言  15
  1.2 糖尿病的病理生理概括  15-17
    1.2.1 Ⅰ型糖尿病  15-16
    1.2.2 Ⅱ型糖尿病  16-17
  1.3 胰岛素信号通路及GLUT4囊泡转运  17-34
    1.3.1 GLUT4的结构、定位及转运模型  17-23
    1.3.2 胰岛素信号通路调控GLUT4囊泡转运  23-29
    1.3.3 细胞骨架对GLUT4囊泡运动的调控  29-34
  1.4 主要研究技术  34-41
    1.4.1 荧光蛋白技术  35-36
    1.4.2 全内反射荧光显微技术  36-41
  1.5 小结  41-43
  1.6 本课题的研究内容、目的与意义  43-45
    1.6.1 本课题的研究内容  43
    1.6.2 本课题的研究目的与意义  43-45
第二章 大鼠原代脂肪细胞的培养及转染模型的建立  45-63
  2.1 前言  45-46
  2.2 材料与方法  46-53
    2.2.1 实验材料  46-48
    2.2.2 大鼠原代脂肪细胞的培养  48-49
    2.2.3 脂肪细胞的鉴定(Hoechst 33324、PI及油红O染色)  49
    2.2.4 HA-GLUT4-GFP质粒的扩增、抽提及鉴定  49-52
    2.2.5 EGFP-IRAP质粒的扩增、抽提及鉴定  52-53
    2.2.6 大鼠原代脂肪细胞的转染  53
  2.3 结果  53-59
    2.3.1 大鼠附睾脂肪组织的形态学特征  53-54
    2.3.2 单个脂肪细胞形态学特征  54-55
    2.3.3 大鼠原代脂肪细胞的鉴定  55
    2.3.4 HA-GLUT4-GFP质粒的鉴定及分析  55-57
    2.3.5 EGFP-IRAP质粒的鉴定及分析  57-58
    2.3.6 大鼠原代脂肪细胞的电转染  58-59
  2.4 讨论  59-63
    2.4.1 酶的选择  59
    2.4.2 实验操作  59-60
    2.4.3 细胞的转染  60
    2.4.4 实验系统的稳定  60-63
第三章 胰岛素对原代脂肪细胞中GLUT4囊泡转运的影响  63-83
  3.1 前言  63-64
  3.2 材料和方法  64-70
    3.2.1 实验材料  64-66
    3.2.2 大鼠原代脂肪细胞的培养及转染  66-67
    3.2.3 GLUT4蛋白的间接免疫荧光染色  67-68
    3.2.4 全内反射荧光显微(TIRFM)技术  68
    3.2.5 大鼠原代脂肪细胞的TIRFM荧光成像  68-69
    3.2.6 TIRF图像处理技术  69-70
  3.3 结果  70-80
    3.3.1 胰岛素对脂肪细胞中内源性的GLUT4转运的影响  70-71
    3.3.2 胰岛素对脂肪细胞中GFP标记的GLUT4转运的影响  71-73
    3.3.3 单个GLUT4囊泡的TIRFM成像  73-76
    3.3.4 胰岛素对单个GLUT4囊泡运动的调节  76-79
    3.3.5 GLUT4囊泡与细胞膜的融合  79-80
  3.4 讨论  80-83
第四章 细胞骨架对原代脂肪细胞中GLUT4囊泡转运的影响  83-95
  4.1 前言  83-84
  4.2 材料和方法  84-86
    4.2.1 实验材料  84
    4.2.2 大鼠原代脂肪细胞的培养及转染  84-85
    4.2.3 微管及微丝蛋白的间接免疫荧光染色  85
    4.2.4 全内反射荧光显微(TIRFM)技术  85-86
    4.2.5 图像处理技术  86
  4.3 结果  86-91
    4.3.1 GLUT4囊泡的沿同一轨迹长距离运动  86-87
    4.3.2 GLUT4囊泡的长距离运动依赖于微管细胞骨架  87-90
    4.3.3 GLUT4囊泡沿微管的双向运输  90-91
  4.4 讨论  91-95
第五章 大鼠原代脂肪细胞中EGFP-IRAP的TIRFM成像  95-105
  5.1 前言  95-96
  5.2 材料和方法  96-97
    5.2.1 实验材料  96
    5.2.2 大鼠原代脂肪细胞的培养及转染  96
    5.2.3 大鼠原代脂肪细胞的间接免疫荧光染色  96
    5.2.4 全内反射荧光显微(TIRFM)技术及Confocal成像  96-97
    5.2.5 图像处理技术  97
  5.3 结果  97-102
    5.3.1 EGFP-IRAP在大鼠脂肪细胞中的分布  97-98
    5.3.2 胰岛素对EGFP-IRAP转运的时间调节性研究  98-100
    5.3.3 EGFP-IRAP的TIRFM成像  100-102
  5.4 讨论  102-105
第六章 C2C12细胞中GLUT4囊泡转运的TIRFM研究  105-115
  6.1 绪论  105-106
  6.2 材料和方法  106-109
    6.2.1 实验材料  106
    6.2.2 C2C12细胞的培养  106-107
    6.2.3 C2C12细胞的间接免疫荧光染色  107-108
    6.2.4 C2C12细胞的脂质体转染  108
    6.2.5 全内反射荧光显微(TIRFM)技术  108
    6.2.6 激光共聚焦显微成像  108-109
    6.2.7 图像处理技术  109
  6.3 结果  109-113
    6.3.1 C2C12细胞中GLUT4及IRAP的定位  109-110
    6.3.2 C2C12细胞中GLUT4及IRAP蛋白的TIRFM成像  110-112
    6.3.3 微管细胞骨架对C2C12细胞中GLUT4囊泡运动的影响  112-113
  6.4 讨论  113-115
第七章 总结与展望  115-119
  5.1 总结  115-118
  5.2 展望  118-119
参考文献  119-145
博士期间相关论文发表情况  145-147
致谢  147

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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