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中国东海海洋微生物环肽类活性物质研究

作　者: 朱洪平
导　师: 焦炳华
学　校: 第二军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 海洋微生物 稻瘟霉 发酵 16S rDNA HPLC 环肽 结构测定 抗肿瘤活性
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


海洋覆盖地球面积70％以上，且生态环境复杂多样。其中蕴育着大量的微生物资源，丰富的生物多样性预示其代谢产物的化学多样性。近期对海洋放线菌的药物筛选揭示，海洋微生物发现新化合物的几率远远高于陆地微生物。因此，海洋微生物以其代谢产物的化学多样性、独特的生理活性和潜在的药物开发前景引起了科学家的广泛关注。在我国的四大海域中，渤海、黄海和南海的微生物资源的研究较多，而对于东海海域微生物的大规模大面积的资源调查、活性菌种的筛选还未见报道。本课题组在2004年5月，从中国东海离岸35海里的区域采集了7个海水、28个海泥样本，利用稀释涂平板法从中分离得到1043株微生物样本，并利用稻瘟霉模型作为活性初筛模型，得到216株对稻瘟霉具有较强抑制活性的菌株。本论文选取了其中一株活性较强的F9947菌株作为研究对象，通过16 SrDNA的PCR扩增、测序以及一系列生理生化特性的研究，对该菌株进行了分类；对该菌株的最适发酵条件进行了摸索；对发酵液的抗稻瘟霉活性成分进行了追踪分离并利用现代光谱学方法（IR、NMR、ESI-MS）对化合物的结构进行鉴定；对这些化合物进行了生理活性的研究。研究结果显示，F9947菌株是一种弱嗜盐菌，最适生长盐度为2.5％。进一步研究发现，该菌在25℃、振荡频率120 r／min、发酵初始pH值为6.0、接种量5％、72～120 h内收获时活性最强；发酵培养基配方为蛋白胨0.4％、酵母提取物0.4％，牛肉膏1％葡萄糖1％。16S rDNA序列扩增、比对及构建进化树显示F9947与Bacillus subtilis strain BFAS的进化位置最接近，它们的相似性高达99.67％，因此鉴定其为枯草芽孢杆菌。生理生化特性的研究显示该菌有着陆地枯草芽孢杆菌的一些基本特征。按最适发酵条件摇瓶发酵得菌液共30 L，离心除菌体后，该菌液显示对稻瘟霉极好的抗性作用，其最大活性稀释倍数为1:256。30 L上清依次用等体积乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，减压蒸干，分别得到乙酸乙酯浸膏10.3 g和正丁醇浸膏48.2 g，经稻瘟霉检测，最小活性浓度分别为7.8μg／mL和0.98μg／mL。对乙酸乙酯浸膏经反复硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，然后通过HPLC纯化制备，共得到了28个化合物，利用核磁共振和质谱等技术，适当辅以一定的物理、化学手段，13个结构已确定，它们分别为：cyclo（D-Pro-D-Ile）、cyclo（L-Pro-L-Val）、cyclo（L-Pro-D-Leu）、cyclo（L-Val-L-Leu）、cyclo（D-Pro-D-Phe）、cyclo（L-Ala-L-Ile）、cyclo（L-Ala-L-Leu）、cyclo（Gly-Tyr）、Uridine、cyclo（L-Pro-L-Ala）、cyclo（L-Ala-L-Phe）、cyclo（Gly-Ala）、cyclo（Ala-Gly-Ser-Val-Gln-Tyr-Pro-Asn-Gly-Asn-Gly）。其中，cyclo（Ma-Gly-Ser-Val-Gln-Tyr-Pro-Asn-Gly-Asn-Gly）为首次发现的新化合物。药理学研究发现，环十一肽对胰腺癌细胞1990和肝癌细胞hul-7也都具有一定的抑制效果，ED50分别为2.12μg／mL和3.22μg／mL。以上所有化合物均显示出很强的抗稻瘟霉活性，MIC＜1μg/mL。据文献报道cyclo（D-Pro-D-Ile）、cyclo（L-Pro-D-Leu）及cyclo （D-Pro-D-Phe）具有较强的抗鳗弧菌（Vibrio anguillarm）活性，MIC分别为：0.05μg／mL、0.12μg／mL、0.03μg/mL。cyclo（L-Pro-L-Val）具有抗生素和植物性毒素能力，cyclo（L-Ala-L-Leu）具有病毒抑制活性。

全文目录


缩写词表  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
化合物的结构  10-12
一、前言  12-17
  (一) 海洋微生物是创新药物的重要资源  12-14
  (二) 海洋微生物开发的现状与前景  14-16
  (三) 本课题的研究意义  16-17
二、实验与结果  17-64
  (一) 东海微生物的分离筛选  17-23
  (二) 菌株F9947的16SrDNA的扩增及序列分析  23-31
  (三) 菌株F9947的最适发酵条件的探索  31-40
  (四) 生物活性物质的分离纯化与结构鉴定  40-61
  (五) 细胞毒活性测定  61-64
参考文献  64-68
致谢  68-69
附录  69-90
  (一) 综述  69-75
  (二) 16SrDNA测序图  75-76
  (三) 波谱图  76-90

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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