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细胞自噬与稻瘟病菌Magnaporthe grisea生长、发育和致病性的关系

作　者: 刘小红
导　师: 闵航；林福呈
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 细胞自噬 稻瘟病菌 MgATG1 MgATG5 附着胞膨压 致病性
分类号: S435.111.41
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


细胞自噬是真核生物中广泛存在的、保守的过程，是一个细胞内长寿命蛋白或细胞器降解和再利用的过程。细胞自噬过程的主要标志是产生双层膜的自噬泡，自噬泡包裹着将要被降解的物质，随后液泡与溶酶体结合。许多年来，真核生物在分化和发育的过程中，细胞自噬过程被认为与细胞的形态建成相关，在细胞器和蛋白质周转的过程中发挥重要作用。遗传数据分析，在酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粘菌(Dictyostelium discoideum)和线虫(Caenorhabdiitis elegans)中，尤其是在低等真核生物中，外界环境的变化，可以诱导细胞自噬发生。稻瘟病是一种毁灭性病害，给全世界的水稻生产带来巨大威胁，稻瘟病是由稻瘟病菌引起的。稻瘟病菌是子囊菌，具有典型的生活史和侵染循环，被认为是是丝状真菌分子生物学和致病机理研究的模式。稻瘟病菌能够形成具有精巧结构的附着胞，一种典型的侵入机构。附着胞细胞壁出现黑色素沉积，最终形成黑色素层。黑色素层允许水分子自由通过，但溶解于水的物质不能自由通过，从而让附着胞建立并维持一个很大的胞内膨压，产生达8.0Mpa的巨大压力，这个压力使稻瘟病菌穿透寄主叶片表皮，侵染寄生。巨大膨压的来源主要是大量脂类、糖原、海藻糖和甘露醇积累的结果。本文主要目的是研究和阐明细胞自噬过程与稻瘟病菌生长、发育和致病性之间的关系。获得的主要研究结果如下：1)在稻瘟病菌附着胞的差减文库中，找到了细胞自噬相关基因的EST(expressed sequence tags)，进而找到基因，定名为MgATG1，该基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。将稻瘟病菌MgATG1基因，互补到酵母ATG1基因缺失突变体中，能够恢复酵母的细胞自噬过程；对MgATG1进行细胞定位，该基因在细胞质中均匀表达；通过构建MgATG1基因置换载体，得到基因MgATG1缺失突变体Δmgatg1。2)Δmgatg1突变体在CM或者MM培养基上的菌落形态发生变化，菌丝稀疏；产孢量显著下降，仅为野生型Guy11的1/15；分生孢子的萌发延迟；分生孢子中，脂质体含量下降；Δmgatg1突变体附着胞膨压显著下降，在完整的水稻或者大麦叶片上不能形成可见病斑，致病性丧失；在有磨损的大麦叶片上只能产生微弱的病斑；突变子在OMA培养基上与2539菌株交配，不能产生子囊壳，育性受到影响；基因MgATG1缺失，细胞自噬过程中断，在液泡和细胞质中，没有自噬泡的积累。3)通过同源序列比对，PCR的方法，得到细胞自噬相关基因MgATG5；利用类似于MgATG1的研究方法分析了MgATG5的功能。稻瘟病菌MgATG5基因，可以恢复酵母ATG5基因缺失突变的功能，使细胞自噬过程恢复；基因在细胞内定位于孢子，菌丝和附着胞的细胞质中，在细胞核中的表达更强。4)基因缺失突变体Δmgatg5，细胞自噬过程中断；菌落形态改变，菌丝稀疏；孢子产量显著下降，分生孢子中脂质体含量下降；与2539菌株的交配，不能形成子囊壳；孢子萌发和附着胞形成滞后；附着胞膨压显著下降；在大麦和水稻上的致病性丧失。细胞自噬过程是真核生物中非常保守的过程，此过程在植物病原真菌中的研究很少，在稻瘟病菌中的研究国内尚属首次，本研究选题新颖；同时，稻瘟病菌作为植物病原菌的研究模式，研究过程中应用的方法对其它病原真菌的研究起到借鉴作用。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章 文献综述  15-44
  1 细胞自噬  15-24
    1.1 细胞自噬的类型  15-16
    1.2 细胞自噬的分子机制  16-21
      1.2.1 细胞自噬的诱导以及物质的选择和包装  17-19
      1.2.2 自噬体的形成  19-21
    1.3 细胞自噬的信号调控  21-23
      1.3.1 Tor信号途径  22
      1.3.2 Class Ⅰ PI3K/PKB途径  22
      1.3.3 Gαi3蛋白  22-23
    1.4 细胞自噬的形态学观察  23-24
      1.4.1 显微镜观察  23
      1.4.2 Monodansylcadaverine(MDC)染色  23-24
      1.4.3 GFP-LC3定位  24
  2 稻瘟病与稻瘟病菌  24-44
    2.1 稻瘟病菌的侵染循环  25-26
    2.2 稻瘟病菌附着胞形成  26-27
    2.3 稻瘟病菌附着胞形成过程中的相关基因  27-33
      2.3.1 参与表面识别的基因  27-29
        2.3.1.1 疏水蛋白  27-28
        2.3.1.2 跨膜蛋白  28-29
      2.3.2 甘油合成相关基因  29-30
      2.3.3 黑色素相关基因  30-31
      2.3.4 产孢相关基因  31-33
    2.4 稻瘟病菌信号传导途径  33-39
      2.4.1 环化腺苷酸(cAMP)信号途径  33-34
      2.4.2 MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号传导途径  34-37
      2.4.3 Ca~(2+)离子途径  37-38
      2.4.4 G蛋白途径  38-39
    2.5 其它致病性相关的基因  39-44
第二章 材料与方法  44-62
  1 试验菌株  44
  2 稻瘟病菌的培养基  44-46
  3 大肠杆菌的培养  46
  4 酵母分析  46-48
    4.1 培养酵母的培养基  46
    4.2 酵母菌落PCR  46-47
    4.3 酵母的高效转化  47-48
  5 PCR  48
    5.1 常规PCR:PCR反应体系(50μl)  48
    5.2 LD-PCR(长距离PCR):PCR反应体系(50μl):  48
  6 DNA分析  48-51
  7 质粒提取  51-52
  8 稻瘟病菌基因组DNA的提取  52-53
  9 稻瘟病菌产孢培养、孢子收集和附着胞诱导培养  53
  10 稻瘟病菌RNA提取和分析  53-55
  11 稻瘟病菌原生质体的制备与转化  55-56
    11.1 原生质体的制备  55
    11.2 转化  55-56
  12 稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交(DIG)  56-58
    12.1 DIG-DNA标记  56
    12.2 基因组DNA的消化、电泳及变性  56-57
    12.3 DNA转膜  57
    12.4 Southern杂交过程  57-58
    12.5 免疫显色  58
  13 稻瘟病菌附着胞的诱导  58-59
  14 水稻(大麦)离体接种  59
  15 水稻(大麦)苗喷雾接种  59
  16 稻瘟病菌的有性杂交  59
  17 稻瘟菌菌侵染过程的组织病理学观察  59-60
  18 稻瘟病菌染色观察  60
    18.1 脂质体的观察  60
    18.2 糖原染色  60
  19 细胞自噬现象的观察  60
  20 荧光表达的观察  60-61
  21 菌落生长速度以及产孢量  61
  22 附着胞形成  61
  23 透射电镜样品制备方法  61-62
第三章 稻瘟病菌细胞自噬基因MgATG1功能的研究  62-93
  1 MgATG1基因的分离和克隆  62-65
  2 MgATG1基因同源性分析  65-67
  3 MgATG1基因的细胞定位  67-70
    3.1 通用载体pBSHPH1的构建  67
    3.2 GFP-MgATG1融合载体的构建  67-69
    3.3 荧光观察  69-70
  4 MgATG1基因缺失突变体的获得  70-75
    4.1 MgATG1基因敲除载体的构建  70
    4.2 Δmgatg1突变体的获得  70-72
    4.3 互补载体的构建  72-73
    4.4 qRT-PCR和RT-PCR  73-75
  5 突变体Δmgatg1的细胞自噬过程中断  75-77
  6 突变体表型分析  77-85
    6.1 突变体Δmgatg1的菌落形态  77
    6.2 突变体Δmgatg1的产孢量下降  77-79
    6.3 交配试验  79
    6.4 孢子萌发和附着胞形成  79-80
    6.5 脂质体含量减少  80-83
    6.6 糖原的移动  83
    6.7 附着胞膨压下降  83-85
  7 突变体Δmgatg1致病性丧失  85-88
    7.1 离体接种  85
    7.2 喷雾接种  85-88
    7.3 病斑数统计和分级  88
  8 Δmgatg1致病机丧失的细胞学观察  88-91
  9 本章小结  91-92
  附:研究稻瘟病菌MgATG1基因试验中的引物  92-93
第四章 稻瘟病菌细胞自噬基因MgATG5功能的研究  93-112
  1 MgATG5基因的分离和克隆  93-94
  2 MgATG5基因同源性分析  94-95
  3 基因缺失突变体和恢复突变体的获得  95-100
    3.1 MgATG5基因置换载体的构建  95
    3.2 基因缺失突变体Δmgatg5的获得  95-97
    3.3 互补载体的构建  97-98
      3.3.1 载体pBAR-ATG5  97
      3.3.2 载体pNGA5B  97-98
      3.3.3 载体pNA5GB  98
    3.4 互补突变体的获得  98-99
    3.5 反转录PCR  99-100
  4 MgATG5基因细胞内GFP定位  100-101
  5 突变体Δmgatg5表型分析  101-104
    5.1 菌落形态的变化  101-102
    5.2 产孢量下降  102
    5.3 孢子萌发和附着胞形成延迟  102
    5.4 附着胞膨压显著下降  102-103
    5.5 突变体Δmgatg5不能形成子囊壳  103-104
  6 突变体Δmgatg5细胞自噬过程被阻断  104-106
    6.1 细胞自噬过程中断  104
    6.2 突变体Δmgatg5对饥饿敏感  104-106
  7 致病性分析  106-108
    7.1 离体接种  106
    7.2 喷雾接种  106-108
  8 Δmgatg5致病性丧失的细胞学观察  108-110
  9 本章小结  110-111
  附:研究稻瘟病菌MgATG5基因试验中的引物  111-112
第五章 全文讨论与今后的工作  112-119
  1 全文讨论  112-115
    1.1 细胞自噬过程是进化上保守的过程  112-113
    1.2 细胞自噬过程是真菌发育所必须的过程  113
    1.3 细胞自噬是物质周转所必须的过程  113-114
    1.4 细胞自噬是稻瘟病菌致病所必须的过程  114-115
  2 本研究的创新点  115
  3 今后的研究工作  115-119
参考文献  119-127

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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