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鸭白细胞介素2配体与受体alpha的研究

作　者: 王金勇
导　师: 周继勇
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 鸭 duIL-2 DuCD25 原核表达 复性 副作用 淋巴细胞增殖 CD25~+细胞 佐剂效应 禽流感病毒
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
下　载: 121次
引　用: 4次
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内容摘要


基于鸡白细胞介素2（chIL-2）全基因序列设计引物探针，以简易基因组抽提法获得的鸭外周血单核细胞基因组DNA为模板，用长距离聚合酶链式反应（LD-PCR）扩增鸭白细胞介素2（duIL-2）全基因片段，得到的duIL-2基因组DNA序列全长为3528bp。运用生物信息学方法对duIL-2的基因结构、启动子结构和预测的成熟蛋白进行系统分析，在此基础上对推测的duIL-2蛋白的三维结构分子模型进行了构建。结果表明：duIL-2基因具有典型的4外显子3内含子结构，与已知的鸡和哺乳类同系物基因总体结构具有明显的相似性；鸭和鸡及其它哺乳动物IL-2基因的启动子序列具有显著的保守性，都具有AP-1，NF-AT，CD28RE，OCT，TATA box转录起始因子结合位点和预测的转录起始位点；推测的duIL-2基因的阅读框长420bp，编码一条由140个氨基酸组成的多肽；duIL-2基因推测的成熟蛋白进化分析表明，鸭和鹅的亲缘关系最近，和哺乳动物的亲缘关系比较远，显示出明显的种属差异；三维结构预测表明，duIL-2蛋白具有典型的四alpha螺旋捆绑结构。以RT-PCR方法克隆的鸭白介素2的cDNA为模板，PCR扩增鸭IL-2成熟蛋白的编码序列。将此序列插入pBAD／HisB和pET28a原核表达载体多克隆位点，构建pBAD／HisB-duIL-2和pET28a-duIL-2重组子，分别转化大肠杆菌LMG194和BL21（DE3）宿主菌，经阿拉糖和IPTG诱导，实现了鸭白介素2蛋白（rduIL-2）体外重组表达。SDS-PAGE分析显示，表达蛋白的分子量约分别为18.7KDa和14.6KDa。Western Blot分析表明，表达的重组蛋白能分别被anti-Xpress和anti-His单克隆抗体识别。以pET28a系统表达的rduIL-2蛋白为原材料，尝试了两种复性策略制备复性rduIL-2蛋白结构单体：一种是借助梯度稀释对变性纯化的rduIL-2单体进行复性；一种是借助FPLC对非变性纯化的rduIL-2单体进行简易氧化复性。前者的复性产物中含有rduIL-2多聚体和单体两种形式，且产率很低。后者可以获得高产量的复性单体。PF-2D分析表明复性单体等电点为3.4，反相二维色谱没有分离到潜在的异构体。非变性条件制备的rduIL-2复性单体4℃存放一周没有形成沉淀，而变性复性策略获得复性产物则形成可见絮状沉淀。以纯化的rduIL-2免疫BALB／c小鼠，将其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，杂交瘤细胞筛选，有限稀释法克隆，成功获得5株能分泌抗鸭IL-2蛋白的单克隆抗体（mAb）细胞系：1H4、283、4G12、5F6和5H6。除mAb 5H6为IgG2a亚类外，其余4株mAb类型均为lgG1亚类，5株mAb的轻链都为κ链。Western-blot分析表明，所获得的5株抗鸭IL-2单克隆抗体与鸭IL-2具有反应性，其中5H6对鸡IL-2具有交叉反应性。细胞免疫化学分析表明，单克隆抗体283、4G12、1A4以及多抗均能够识别真核细胞瞬时表达系统表达的鸭重组IL-2。体外阻断实验证明，mAb 2B3能够明显抑制duIL-2对鸭脾细胞的增殖效应。以rduIL-2复性单体为活性标准品，进行了鸭白介素2体内外生物学活性研究：用MTT法测定了rduIL-2的体外淋巴细胞增殖活性；以鸡为模型，静脉注射rduIL-2，观察其体内生物学效应；研究了rduIL-2蛋白对重组禽流感灭活疫苗免疫效力的影响。结果表明：rduIL-2复性单体能刺激T淋巴细胞增殖，且呈剂量依赖性；高剂量连续注射rduIL-2引起鸭发热、多脏器炎症等毒副作用；鸡静脉注射低rduIL-2（0.1-25μg）后，其CD4+T细胞上调，且上调水平与注射剂量没有直接相关性，而CD8+T细胞含量变化不明显。低剂量的鸭IL-2能够明显提高重组禽流感灭活疫苗HI效价，而剂量过高则会抑制重组禽流感灭活疫苗免疫效力。根据鸡白介素2受体alpha链（ChlL-2Rα）cDNA序列设计多对引物探针，结合RACE技术克隆了duIL-2受体alpha cDNA（命名为DuCD25或者duIL-2Rα）。克隆的cDNA序列长886bp，其cDNA编码一条由226个氨基酸组成的前体蛋白，该前体蛋白含有由20aa残基构成的信号肽序列；预测的duIL-2Rα成熟蛋白与鸡IL-2Rα同源性61％，与哺乳类同系物同源性在15-25％之间。对10个物种IL-2Rα氨基酸序列分析发现，禽类和哺乳类有23个aa对应位点完全保守。duIL-2Rα的8个半胱氨酸残基中，有7个对应位点与鸡和哺乳类完全保守；我们也发现，哺乳类IL-2Rα的P24-P25、N90-A91、P111-K112、1185-R186位点之间和胞内羧基末端，在进化过程中分别出现了1、3、1、26-29和9-16个氨基酸插入现象，然而在进化过程中，哺乳类IL-2Rα并没有发生任何aa残基缺失的现象。二级结构分析表明，duIL-2Rα成熟蛋白羧基末端含有25个氨基酸残基（182-206）构成的跨膜区。将duIL-2Rα胞外链PCR产物亚克隆入原核表达载体pET32a，构建重组表达载体pET32a-duIL2Rα，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导实现了duIL2Rα蛋白在大肠杆菌的表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达蛋白的分子量约为40KDa，可以被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明，经pET32a系统表达的duIL-2Rα主要以包涵体的形式存在。表达的重组蛋白经Ni2+层析柱变性纯化产率极低，采用制备包涵体的方法，每升培养液中可获得32mg rduIL2Rα蛋白粗制品。用纯化的rduIL-2Rα包涵体蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠，经细胞融合，杂交瘤细胞筛选，有限稀释法克隆，最终获得15株持续、稳定分泌抗rduIL-2Rα原核表达产物的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1A4，3B6，7C8，1C5，3D1，1E4，2E1，6E1，6E9，2F4，6F2，4G10，3H11，4H3，6H7（抗体类型均为IgG1，κ）。对15株单抗Western blot鉴定结果表明，与rduIL-2Rα均具有反应性。细胞免疫化学分析表明，仅有5株（1A4，3H11，4G10，3D1，6F2）能够特异识别经Vero细胞瞬时表达的duIL-2Rα蛋白。进一步利用Con A诱导的内源性duIL-2Rα作为抗原，筛选到两株能够识别duIL-2Rα天然表位的抗体（3H11，6F2）。利用H9N2亚型禽流感病毒感染模型，以rduIL-2 Rα单克隆抗体6F2为检测抗体，借助流式细胞术，研究了鸭DuCD25+细胞在病毒感染免疫应答中的表达动态。结果表明，健康鸭脾细胞仅有少量DuCD25+细胞（＜4％），而感染鸭脾细胞中的DuCD25+细胞比率以固定斜率直线式迅速上调，到48h达到峰值，随后逐渐下降，至感染后144h降至正常水平，说明DuCD25+细胞在机体抗病毒感染的免疫应答过程中扮演着重要角色。

全文目录


论文课题来源  9-10
摘要  10-12
Abstract  12-15
论文创新点  15-16
研究内容  16-115
  第一章 鸭白介素2基因克隆与生物信息学分析  16-30
    1 材料  17
    2 方法  17-18
      2.1 鸭白介素2基因组克隆  17-18
      2.2 鸭白介素2生物信息学分析  18
    3 结果  18-28
      3.1 duIL-2全基因DNA片段扩增和序列测定  18-19
      3.2 duIL-2基因结构  19
      3.3 duIL-2基因的启动子调节位点  19-20
      3.4 鸭和其他动物IL-2氨基酸同源性分析  20
      3.5 duIL-2成熟蛋白进化树分析  20-22
      3.6 IL-2蛋白的三维结构预测  22-28
    4 讨论  28-30
  第二章 不同原核系统对重组鸭白介素2的表达  30-48
    1 材料  31
    2 方法  31-37
      2.1 脾淋巴细胞的诱导培养及总RNA的抽提  31
      2.2 RT-PCR  31-32
      2.3 鸭IL-2 cDNA克隆及鉴定  32
      2.4 重组载体构建及鉴定  32-33
      2.5 rduIL-2的诱导表达  33
      2.6 SDS-PAGE与Western blot鉴定  33-34
      2.7 变性纯化  34
      2.8 天然纯化  34-35
      2.9 FPLC纯化单体  35
      2.10 rduIL-2复性  35-36
      2.11 天然电泳分析  36
      2.12 PF-2D分析  36-37
    3 结果  37-46
      3.1 RT-PCR产物的克隆及鉴定  37
      3.2 重组表达质粒的构建与鉴定  37-39
      3.3 SDS-PAGE鉴定  39-40
      3.4 Western blot鉴定  40
      3.5 rduIL-2产物的纯化  40-41
      3.6 可溶性rduIL-2单体的分离  41-42
      3.7 rduIL-2复性  42
      3.8 等电点与异构体分析  42-46
    4 讨论  46-48
  第三章 抗重组鸭IL-2抗体的制备与鉴定  48-61
    1 材料  49-50
      1.1 实验动物、生化试剂及培养基  49
      1.2 抗原和抗体  49-50
    2 方法  50-54
      2.1 单克隆抗体的制备  50-51
      2.2 duIL-2多抗血清的制备  51
      2.3 抗原捕获ELISA  51-52
      2.4 识别真核表位抗体鉴定  52-53
      2.5 抗体抑制实验  53-54
    3 结果  54-59
      3.1 单克隆抗体制备  54-55
      3.2 单克隆抗体亚类及腹水效价检测  55
      3.3 抗duIL-2多克隆抗体效价测定  55
      3.4 抗原捕获ELISA  55-56
      3.5 抗duIL-2单克隆和多克隆抗体功能鉴定  56-59
    4 讨论  59-61
  第四章 鸭白介素2生物学活性与毒副作用  61-74
    1 材料  62-63
    2 方法  63-66
      2.1 IL-2的制备  63
      2.2 DuIL-2 DNA质粒大量制备、鉴定和浓度测定  63-64
      2.3 体外生物学活性  64
      2.4 体内生物学活性  64
      2.5 体内毒性研究  64-65
      2.6 rduIL-2,duIL-2 DNA载体对AIV油乳剂灭活苗免疫效力的影响  65-66
    3 结果  66-70
      3.1 rduIL-2蛋白的体外生物学活性  66-67
      3.2 rduIL-2蛋白的体内生物学活性  67-68
      3.3 体内副作用  68-69
      3.4 rduIL-2蛋白,duIL-2 DNA载体的疫苗佐剂效应  69-70
    4 讨论  70-74
  第五章 duIL-2Rα cDNA克隆与生物信息学分析  74-87
    1 材料  75-76
      1.1 实验动物  75
      1.2 菌种及质粒  75
      1.3 工具酶及试剂  75-76
    2 方法  76-79
      2.1 引物设计  76-77
      2.2 鸭脾细胞分离与培养  77
      2.3 脾细胞总RNA的抽提  77
      2.4 含通用标签的总cDNA第一链合成  77-78
      2.5 引物探针梯度PCR(3'-RACE)  78
      2.6 特异性小标签鉴定  78
      2.7 序列测定拼接及生物信息学分析  78-79
    3 结果  79-85
      3.1 RT-PCR  79-81
      3.2 测序结果  81
      3.3 信号肽,成熟蛋白跨膜区,糖基化位点分析  81-83
      3.4 鸭和其他动物IL-2Rα cDNA编码的氨基酸同源性及进化树分析  83-85
    4 讨论  85-87
  第六章 重组鸭IL-2Rα原核表达与鉴定  87-95
    1 材料  87-88
      1.1 质粒、菌株和生化试剂  87-88
      1.2 单克隆抗体和酶标抗体  88
      1.3 常用缓冲液和培养基配制  88
    2 方法  88-90
      2.1 重组表达质粒的构建及序列测定  88
      2.2 重组鸭IL-2Rα在pET32a表达系统中的表达与鉴定  88-90
    3 结果  90-92
      3.1 重组表达质粒pET32a-duIL2Rα的鉴定  90-91
      3.2 最佳诱导时间的确定  91
      3.3 Western blot鉴定  91-92
      3.4 duIL-2Rα的纯化  92
    4 讨论  92-95
  第七章 抗重组鸭IL-2Rα抗体的制备与鉴定  95-110
    1 材料  96
      1.1 实验动物、生化试剂及培养基  96
      1.2 抗原和抗体  96
      1.3 菌株、质粒、细胞系  96
    2 方法  96-101
      2.1 动物免疫  96
      2.2 杂交瘤细胞株的建立、筛选及克隆化  96-97
      2.3 Western blot  97
      2.4 单克隆抗体Ig类别、亚类测定  97
      2.5 多抗血清的制备  97
      2.6 识别真核表达rduIL-2Rα蛋白的抗体筛选  97-99
      2.7 腹水的制备及效价测定  99
      2.8 识别内源性duIL-2Rα蛋白的抗体筛选  99-100
      2.9 CD25~+细胞流式分析法建立  100
      2.10 抗体抑制实验  100-101
    3 结果  101-107
      3.1 细胞株的筛选及克隆化  101
      3.2 ELISA检测结果  101
      3.3 Western blot检测及亚类鉴定  101-102
      3.4 腹水制备及其效价  102-103
      3.5 识别真核表位抗体筛选  103-104
      3.6 识别内源性CD25抗原表位的抗体筛选  104-106
      3.7 流式法检测DuCD25~+细胞的建立  106-107
      3.8 抗体阻断实验  107
    4 讨论  107-110
  第八章 禽流感病毒H9N2亚型感染鸭CD25表型细胞的动态分析  110-115
    1.材料  111-112
      1.1 病毒  111
      1.2 动物  111
      1.3 试剂  111-112
    2.方法  112
      2.1 动物感染  112
      2.2 流式用脾细胞样品分离  112
      2.3 CD25表型细胞的动态分析  112
    3.结果  112-113
    4 讨论  113-115
文献综述  115-138
  第一章 IL-2研究综述  115-128
    1 IL-2分子生物学研究  115-117
      1.1 IL-2的发现及分子克隆  115-116
      1.2 IL-2基因表达与调控  116
      1.3 IL-2蛋白结构与突变体  116-117
    2 内源性IL-2纯化  117-118
    3 IL-2重组表达  118-120
      3.1 原核表达  118
      3.2 真核表达  118-120
    4 抗IL-2抗体  120
    5 IL-2的检测方法  120-122
      5.1 ELISA与ELISPOT  120-121
      5.2 IL-2活性检测法  121-122
    6 IL-2效应细胞  122-123
      6.1 IL-2对抗原激活T细胞的效应  122
      6.2 IL-2对抗原激活B细胞的效应  122-123
      6.3 IL-2对NK细胞的效应  123
    7 IL-2转基因、基因敲除和疾病研究模型  123-124
    8 IL-2药效动力学  124
    9 IL-2的副作用  124-125
    10 IL-2的应用  125-126
      10.1 人IL-2蛋白的应用  125-126
      10.2 动物IL-2基因免疫  126
    11 禽IL-2研究进展  126-127
    12 结论  127-128
  第二章 IL-2受体alpha研究综述  128-138
    1 IL-2Rα分子生物学  128-132
      1.1 IL-2Rα的发现  128
      1.2 IL-2Rα的分子克隆与基因结构  128-129
      1.3 IL-2Rα基因的转录与诱导因子  129-130
      1.4 IL-2Rα体外表达  130-131
      1.5 IL-2Rα蛋白结构与功能分析  131-132
      1.6 IL-2Rα转基因模型  132
    2 Anti-TAC抗体  132-134
      2.1 Anti-TAC的制备  132-133
      2.2 Anti-TAC免疫学功能  133
      2.3 Anti-TAC与βγ的发现  133-134
      2.4 sIL-2Rα  134
      2.5 anti-TAC与IL-2Rα发育生物学  134
    3 IL-2Rα细胞亚群  134-136
    4 IL-2Rα应用研究  136
      4.1 抗体导弹(与其他如毒素偶连或者融合)  136
      4.2 人源化IL-2Rα抗体  136
    5 禽IL-2Rα研究进展  136-137
    6 总结  137-138
全文结论及后续工作设想  138-139
参考文献(References)  139-157
附录 常用缓冲液及培养基配方  157-164
致谢  164-165
攻读博士期间的科研成果  165-166

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