心肌线粒体的功能和代谢改变，在心肌缺血缺氧的发病机理中处于非常重要的地位，心肌线粒体损伤诱导的凋亡蛋白表达的过程是多因素、多环节参与的病理过程，对它致病机理的研究已成为当今的热点。蛋白质组学是“后基因组时代”蓬勃发展的技术" />

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乙醛脱氢酶2（ALDH2）对大鼠心肌缺氧损伤的保护作用

作　者: 徐丹令
导　师: 王克强；孙爱军；葛均波
学　校: 复旦大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 心肌线粒体蛋白质组质谱乙醛脱氢酶2 ALDH2(乙醛脱氢酶) daidzin 缺氧心肌凋亡 MAPK
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

缺血缺氧引起心肌线粒体的学位论文">心肌线粒体的功能和代谢改变，在心肌缺血缺氧的发病机理中处于非常重要的地位，心肌线粒体损伤诱导的凋亡蛋白表达的过程是多因素、多环节参与的病理过程，对它致病机理的研究已成为当今的热点。蛋白质组学是“后基因组时代”蓬勃发展的技术体系新型学科群，其特点是采用高通量、高分辨率的蛋白鉴定技术，全景式研究在特定病理条件下的蛋白表达谱，由此在蛋白质水平上对疾病发生、细胞代谢等过程有更全面的认识，可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物和新关键分子，极大地丰富诊断标志物的选择及对复杂致病机理的全面阐明。本研究针对大鼠心肌缺血缺氧模型的心肌线粒体，进行全蛋白质组表达谱差异分析，筛出一些有潜在应用价值的差异蛋白，并在心肌组织和心肌细胞对其中的差异分子，用特异的抑制剂和基因转染等细胞和分子生物学技术进行功能的分析和验证。第一部分大鼠心肌缺血缺氧模型的线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)蛋白质分析目的：利用差异蛋白质谱识别缺血缺氧大鼠心肌线粒体代谢异常的蛋白。材料和方法：实验动物分心梗组和对照组(每组9只)。对大鼠行左冠脉前降支结扎，术后4周，以LVEF达46.4±10.9％左右作为成功建立大鼠心梗模型，将之处死后，分别取左心室：先制作电镜标本，观察形态改变；然后进行心肌线粒体抽提，利用双向凝胶电泳技术显示差异蛋白的表达谱，再进行质谱鉴定和蛋白数据库分析。发现蛋白的表达差异后，分别在心梗3d、7d、14d和28d后，用RT-PCR和western blot方法证实心肌该蛋白的mRNA和蛋白质表达随时间变化的差别。另一方面，在用酶消化法获得心肌细胞后，制作细胞的缺氧模型，测定离体心肌细胞线粒体该蛋白酶在不同缺氧时间内的活性变化。结果：大鼠心梗的心肌线粒体电镜下出现线粒体肿胀，基质变淡，嵴膜疏短破坏等病理变化。在双向凝胶电泳技术显示差异蛋白的表达谱，发现其中有3个点表达有显著差异，经胶内酶解后，行质谱鉴定和蛋白数据库分析，其中一条蛋白被证实为乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase 2 ALDH2)，它在大鼠缺血缺氧心肌中的表达显著下降，并随心梗时间延长，心肌ALDH2的mRNA和蛋白质的表达呈逐渐下降趋势。在细胞水平的心肌线粒体(纯度达90％以上)，用乙醛代谢法测得ALDH2的酶活性也随缺氧时间的延长而下降。结论：在缺血缺氧大鼠的心肌线粒体中乙醛脱氢酶2表达显著下调，心肌缺血缺氧与ALDH2的表达和活性下降相关。第二部分乙醛脱氢酶2(ALDH2)抑制剂daidzin对大鼠心肌细胞缺氧损伤作用的机制目的：检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)被daidzin抑制时对大鼠心肌细胞在缺氧状态下发生凋亡和信号转导的影响，验证乙醛脱氢酶2(ALDH2)在此过程中所起的作用。材料和方法：在确定daidzin的最佳抑制浓度后，运用心肌细胞缺氧模型，比较大鼠心肌细胞在单独缺氧和经ALDH2特异性抑制剂daidzin预处理24h后缺氧的凋亡和MAPK信号通路的改变。酶活性检测采用乙醛代谢法、ROS的检测用C400测定，凋亡的测定通过用Hoechest 33324、免疫荧光标记的流式细胞仪和TUNEL试剂盒检测，MAPK信号通路酶(ERK1／2、JNK、P38)磷酸化的改变用western blotting的方法检测。结果：60uM daidzin浓度是ALDH2酶活性被抑制而细胞无凋亡发生的最佳工作浓度。在daidzin(60uM)预处理24h后再经缺氧诱导，比单独缺氧引起的心肌细胞凋亡更为明显：表现为在Hoechest 33324染色中，细胞核溶解和核碎裂(P＜0.05)，在FACS和TUNEL的检测中，凋亡细胞明显增加(P＜0.05)，经凋亡后的死亡细胞有增加趋势但无统计学差异，同时与MAPK信号通路有关的磷酸化ERK1／2、JNK和P38的酶活性均表达增强。结论：daidzin使ALDH2酶活性降低可增加心肌细胞对缺氧导致凋亡的易感性，其机理是与细胞ROS和凋亡的增加及MAPK信号通路的激活有关。ALDH2对缺氧引起的细胞凋亡损伤具有保护作用。第三部分乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因对大鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用的机制目的：通过检测转染野生和缺失型乙醛脱氢酶2(ALDH2*1／ALDH2*2)基因，对大鼠心肌细胞在缺氧状态下发生凋亡和信号转导的影响，进一步证明乙醛脱氢酶2(ALDH2)在此过程中所起的作用。材料和方法：运用细胞缺氧模型(同上)，比较大鼠心肌细胞在转染野生和缺失型乙醛脱氢酶2(ALDH2*1／ALDH2*2)基因再缺氧后ROS、4—HNE、凋亡、MAPK酶活性、bcl2和P53的改变，酶活性检测采用乙醛代谢法、ROS的检测用C400测定，凋亡的测定通过用Hoechest33324、免疫荧光标记的流式细胞仪和TUNEL试剂盒检测，4—HNE的检测用免疫组织化学法，MAPK信号通路酶(ERK1／2、JNK)磷酸化的改变用westernblotting的方法检测，而bcl2和P53分别用RT-PCR和western blotting的方法检测。结果：转染ALDH2野生型(ALHD2*1)和缺失型(ALDH2*2)基因后再缺氧，表现为转染缺失型(ALDH2*2)的心肌细胞对缺氧性损伤的耐受性明显差于野生型(ALHD2*1)的(P＜0.05)。与运用ALDH2特异性抑制剂daidzin不同的是：转染ALHD2*1和ALDH2*2后再缺氧，都对ROS的产生和MAPK途径(ERK1／2和JNK的磷酸化)没有影响(P＞0.05)；而在转染缺失型ALDH2*2基因再缺氧组，除了有细胞凋亡的增加外(P＜0.05)：表现在Hoechest 33324染色(核溶解和核碎裂)，FACS和TUNEL检测，还有4—HNE的明显增加(P＜0.05)。从bcl2和P53的RT-PCR和western blot结果分析，转染野生型(ALHD2*1)的缺氧心肌细胞bcl2表达增高，P53表达下降，与缺失型(ALDH2*2)的结果相反。结论：4—HNE可能是细胞氧化损伤的重要作用因素。ALDH2*1可降解氧化物质4—HNE，它的抗凋亡作用不以ROS-MAPK途径为主，有可能与bcl2—P53的ROS非依赖性刺激的凋亡途径有关，ALDH2酶活性降低可增加心肌细胞对缺氧导致凋亡的易感性，ALDH2对缺氧引起的细胞凋亡损伤具有保护作用。结论1．缺血缺氧性损伤可能与大鼠心肌线粒体中乙醛脱氢酶2(ALDH2)的表达和活性显著下降有关。2．daidzin使ALDH2酶活性降低后，心肌细胞对缺氧的耐受性下降，并对缺氧导致凋亡的易感性增加，此时细胞ROS和凋亡的增加与MAPK信号通路的激活有关。3．转染ALHD2*1和ALDH2*2对缺氧损伤的心肌细胞ROS的产生和MAPK(ERK1／2和JNK)途径没有影响。ALDH2*1可降解氧化物质4—HNE，它的抗凋亡作用不以ROS-MAPK途径为主，可能与bcl2—P53的ROS非依赖性刺激的抗凋亡途径有关。4．ALDH2酶活性降低可增加心肌细胞对缺氧导致凋亡的易感性，ALDH2对缺氧引起的细胞凋亡损伤具有保护作用。潜在价值和创新点1．我们首次通过蛋白质组学技术发现乙醛脱氢酶2(ALDH2)在缺血缺氧心肌中表达下降，并初步证实其具有心肌细胞保护作用。2．基于ALDH2的心肌保护作用，我们推测ALDH2基因缺失型这类人群在心肌梗死或高血压后更易发心力衰竭，预后更差，同时也为临床的药物治疗提供靶点。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
英文缩写  11-13
前言  13-16
  参考文献  14-16
第一部分大鼠心肌缺血缺氧模型的线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)蛋白质分析  16-33
  前言  16
  材料和方法  16-25
  结果  25-28
  讨论  28-31
  参考文献  31-33
第二部分乙醛脱氢酶2(ALDH2)抑制剂daidzin对大鼠心肌细胞缺氧损伤作用的机制  33-46
  前言  33
  材料和方法  33-36
  结果  36-41
  讨论  41-44
  参考文献  44-46
第三部分乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因对大鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用的机制  46-65
  前言  46
  材料和方法  46-51
  结果  51-57
  讨论  57-62
  参考文献  62-65
文献综述  65-79
发表论文  79-80
致谢  80-82

乙醛脱氢酶2（ALDH2）对大鼠心肌缺氧损伤的保护作用

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