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亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因的研究

作　者: 程天印
导　师: 施启顺；林矫矫
学　校: 湖南农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖学
关键词: 亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库 GP29基因 GP15基因克隆表达
分类号: Q969.91
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 105次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

从单雌蜱繁殖群中选出未吸血雌成蜱60只,随机分成两组,一组半饱血,另一组不吸血。分离未吸血和半饱血两状态下的蜱唾液腺。经过总RNA提取,第一链合成、长距离扩增、Ras Ⅰ酶切、添加接头,扣除性杂交和选择性扩增等步骤,分离出差异表达基因的cDNA片段。将第二次扩增产物的纯品插入pGEM T-Easy载体,转化DH5a感受态。通过克隆鉴定和序列测定,获得120个有效片段,其中84个认定为序列表达标签（EST）。RT-PCR分析证实,由文库随机选出的10个片段在吸血的雌成蜱唾液腺表达,未吸血的不表达。与NCBI数据库的片段进行序列比对,结果如下:文库里的120个片段中,90个找到了具有一定相似性的序列,其中与其他蜱的已知基因具有相似性的片段21个,与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫基因有一定相似性的片段19个。在与蜱已知基因有相似性的21个片段中,7片段被认定为EST,其中5个具有Poly（A）,2个具有ACGCGGGG;2个既具Poly（A）又具ACGCGGGG（即为全长基因,其中1个已被Genbank接收,登录号为DQ021902）。HaB1和Ha7.7是从上述与蜱已知基因有相似性的EST中筛选而来。根据HaB1的序列设计出HaB1未知末端扩增引物HaB1-GSP₁和HaB1-GSP₂。用HaB1-GSP₁和UAP扩增由半饱血雌成蜱唾液腺总RNA反转录而成的第一链,HaB1-GSP₂和AUAP做巢式扩增,即得HaB1的未知3’-末端。根据HaB1及其3’-末端序列拼接结果,设计GP₂₉的全长扩增引物HaB1-FLP⁺、HaB1-FLP^-,以此扩增cDNA第一链获得新基因GP₂₉（登录号:AY803896）全长。如上设计扩增Ha7.7之5’-端的引物Ha7.7-GSP₁、Ha7.7-GSP₂、Ha7.7-GSP₃和扩增GP₁₅的全长引物Ha7.7-FLP⁺、Ha7.7-FLP^-。克隆Ha7.7得其未知部分和全长GP₁₅（登录号:DQ020265）。RT-PCR分析表明:亚洲璃眼蜱成蜱唾液腺只在吸血时表达两基因。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
第一章蜱唾液腺活性分子的研究现状  8-19
第二章亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建  19-37
第三章目的片段的筛选与新基因GP_(29)和GP_(15)的克隆  37-57
第四章唾液腺新基因GP_(29)的表达与鉴定  57-70
第五章唾液腺新基因GP_(15)的表达及鉴定  70-82
总结  82-84
参考文献  84-97
致谢  97-98
作者简介  98-99
附录  99-119
  1，新基因1  99-100
  2，新基因2  100-101
  3，新基因3  101-102
  4，研究中应用的通用引物  102-103
  5，GP_(29)的全长序列拼接图  103-104
  6，GP_(15)的全长序列彩图  104-105
  7，目的蛋白的酶切肽段预测  105-111
  8，肽谱检索的结果  111-113
  9，研究中常用试剂的配法  113-115
  10，论文中的重要缩写符号  115-116
  11，pGEM-T Easy的克隆区  116-117
  12，pGEX-4T-1，2，3的克隆区  117-118
  13，pET32a—c(+)的克隆区  118-119
  14，抑制性消减杂交原理图  119

亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因的研究

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