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微生物法还原羰基化合物制备手性药物中间体的研究

作　者: 欧志敏
导　师: 岑沛霖；杨立荣
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 酵母细胞生物还原辅酶再生氯代苯乙酮氯代苯乙醇产物产率对映体过剩值动力学
分类号: TQ460
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

近年来，随着对不同光学异构体药物药理作用研究的进展及对消旋药物申报和使用的种种限制，手性药物的研究和开发已经成为国际新药研究的热点和方向。由此而来的手性化合物合成方法就成了手性药物能不能商品化生产的关键。许多研究者都在致力于研究和开发产物转化率高、手性选择性好的手性化合物合成路线，其中生物转化法由于其温和的反应条件及高度的手性选择性而受到人们的青睐。氯代苯乙酮是许多重要手性药物的先导化合物，文献中已经有了采用微生物法立体选择性地还原羰基化合物制备各种手性醇的报道，本文将对微生物法还原氯代苯乙酮类化合物制备手性氯代苯乙醇进行系统深入的研究。现有的有机化学品市场没有本文所研究的手性或消旋的氯代苯乙醇供应，为此必须自行合成氯代苯乙醇作为研究工作的标准品。在实验室条件下采用化学法还原2’-氯-苯乙酮，3’-氯-苯乙酮和4’-氯-苯乙酮，制备出了外消旋的2’-氯-1-苯乙醇，3’-氯-1-苯乙醇和4’-氯-1-苯乙醇。经分离提纯后获得的产物醇纯度达到了99％以上，同时，对外消旋化合物中两种手性异构体的分析方法进行了研究，通过对手性柱的选择和气相色谱条件的优化，使两种对映体得到了良好的分离，为研究工作的顺利开展创造了条件。从十一株实验室保藏的酵母菌株中筛选出了四株对氯代苯乙酮具有不对称还原能力的菌株，包括两株酿酒酵母S.cerevisiae P2及S.cerevisiae B5和两株假丝酵母C.pseudotropicalis 104及C.utilis 1257，其中以S.cerevisiae B5的还原效果最佳，还原产物不但有较高的产率，而且有很好的立体选择性。在2’-氯-苯乙酮，3’-氯-苯乙酮，4’-氯-苯乙酮和3-氯-1-苯丙酮等一系列底物中，S.cerevisiae B5对2’-氯-苯乙酮的还原效果最好。深入研究了S.cerevisiae B5还原2’-氯-苯乙酮制备R-2’-氯-1-苯乙醇的过程。研究结果标明，产物R-2’-氯-1-苯乙醇的对映体过剩值可达到100％。考察了甲醇，乙醇，2-丙醇，正丁醇，葡萄糖，甘油和乳酸等辅助底物对还原产物产率和手性选择性的影响，确定了最佳辅助底物为乙醇，最佳浓度为5％。乙醇的功能是在醇脱氢酶的催化下实现辅酶Ⅰ(NADH)的原位再生并用于补充底物还原反应中NADH的消耗。对S.cerevisiae B5还原2’-氯-苯乙酮制备R-2’-氯-1-苯乙醇的反应条件进行了优化，当反应时间为24小时pH为8.0及反应温度为25℃时产物的产率最高。研究了底物浙江大学博士学位论文摘要浓度、酵母细胞用量及酵母培养条件和还原反应条件对反应产率和立体选择性的影响，发现底物对生物还原反应有抑制作用，增加酵母用量可提高产物的产率，好氧条件下培养酵母并在好氧条件下进行生物还原也有利于提高产物的产率。采用分批加入底物的方法能减轻底物抑制作用，提高转化率。同时还研究了重复利用5. cerevisia。BS细胞用于生物还原，发现酵母细胞重复利用巧次后仍有一定的生物活性。实验研究了S。。revisiae BS和C Pseudot尸opicalis 104还原3一氯一1一苯丙酮制备R一3-氯一1一苯丙醇的过程。s.。erevisi“。BS和c Psoudo介’oP icalis 104还原3一氯一1·苯丙酮合成R一3一氯一1一苯丙醇的对映体过剩值均达到100%，两者的产物产率类似，都能达到约50%。研究发现最佳辅助底物也是5%的乙醇，5. cerevisia。BS和cPsoudot了’oP icali，104还原3一氯一1一苯丙酮的最佳反应时间均为24小时，最佳pH均为pH6.0，最适温度分别为25℃和30℃。分别考察了底物浓度、酵母细胞加入量、酵母细胞培养条件和还原反应条件对反应产率和立体选择性的影响。考察了分批加入底物对还原效果的影“向。深入研究了在乙醇存在卜生物还原过程中酵母细胞内NADH、NAD十、NADPH及NADP一于浓度的变化规律，发现胞内NADPH浓度迅速降低到零，而NADH浓度始终维持在较高水平，证明了用于底物还原反应的辅酶是NADH，辅助底物乙醇的加入有利于实现辅酶I(NADH)的原位再生。推导得到了包括辅酶的双底物顺序酶催化反应机理的数学模型，针对S.。erevisia召BS催化还原2’一氯一苯乙酮的反应过程，从实验数据回归得到了模型参数。动力学参数为: 珠l二8 .0只20一moL几·h，KmB、=9.0火20“4 moL几，Ks人l二2.0火10一6 moL几动力学方程为: 8火1尹[2，一chl二oaeetoPhenone〕〔NADH〕V; .二一9又10一‘[N肋H卜9只一。一4火2火20一6+[2，一。hz。roaeetophenone」[NADH〕将上述模型用于实验数据时，计算曲线与实验数据能很好地吻合，说明这一过程符合顺序反应机制。考察了水/有机相两相体系中5.cerevisl’a。BS对2’一氯一苯乙酮的还原情况。在所研究的有机溶剂中，发现十二烷为最佳有机溶剂，产物产率比水相中反应提高了10.8浙江大学博士学位论文摘要倍。进一步对5. cerevisiaeBS的还原活性与有机溶剂的疏水性(LogPot。)进行了相关性分析。对水/十二烷两相体系中十二烷的含量对还原活力倍数的影响进行了探讨。

全文目录

摘要  11-14
Abstract  14-18
第一章文献综述  18-49
  1.1 手性合成研究的意义  18-22
    1.1.1 手性合成在制药领域中的应用  18-21
      1.1.1.1 手性药物的研究是国际新药研究的新方向  18-20
      1.1.1.2 迅猛增长的市场需求，刺激了手性药物的研究和开发  20
      1.1.1.3 手性新药的不断出现，改变着化学药品的构成和方向  20-21
      1.1.1.4 手性药物的迅速发展，促进了手性合成工业的崛起  21
    1.1.2 手性合成技术在其它领域的应用  21-22
  1.2 获得手性化合物的方法  22-26
    1.2.1 物理法  22
      1.2.1.1 晶体机械分离拆分法  22
      1.2.1.2 手性溶剂结晶法  22
      1.2.1.3 接种晶体析解法  22
    1.2.2 化学法制备手性化合物  22-25
      1.2.2.1 化学法拆分  23-24
      1.2.2.2 潜手性化合物的不对称合成  24-25
    1.2.3 生物法制备手性化合物  25
    1.2.4 色谱拆分法  25-26
    1.2.5 手性膜拆分法  26
  1.3 微生物转化反应在药物合成中的应用  26-31
    1.3.1 概述  27
    1.3.2 微生物转化反应的特点  27-29
    1.3.3 微生物转化方法  29-30
      1.3.3.1 分批培养转化法  29
      1.3.3.2 静止细胞转化法  29
      1.3.3.3 应用孢子进行生物转化  29-30
      1.3.3.4 应用渗透细胞进行转化  30
      1.3.3.5 应用固定化细胞进行转化  30
    1.3.4 影响微生物转化的因素  30-31
      1.3.4.1 底物添加方法的影响  30-31
      1.3.4.2 酶诱导剂的作用  31
      1.3.4.3 酶的抑制剂  31
  1.4 应用于选择性生物催化的微生物  31-32
    1.4.1 面包酵母(Baker's yeast)  31-32
    1.4.2 其他微生物  32
  1.5 微生物法还原羰基化合物制备手性药物中间体  32-40
    1.5.1 微生物法还原羰基化合物的原理  32-34
    1.5.2 微生物法还原制备手性药物中间体的实例  34-35
    1.5.3 控制反应立体选择性的方法  35-40
      1.5.3.1 选择合适的微生物  35-36
      1.5.3.2 选择合适的底物  36
      1.5.3.3 预热处理微生物细胞  36-37
      1.5.3.4 添加辅助底物或抑制剂  37
      1.5.3.5 控制微生物细胞的培养条件  37-38
      1.5.3.6 固定化微生物  38
      1.5.3.7 选择合适的反应溶剂体系  38-39
      1.5.3.8 利用基因工程技术改善细胞功能  39-40
  1.6 本论文的结构  40-41
  参考文献  41-49
第二章化学法还原氯代苯乙酮类化合物制备氯代苯乙醇  49-60
  2.1 引言  49
  2.2 化学还原酮类化合物方法简介  49-50
    2.2.1 催化加氢  49
    2.2.2 用金属氢化物还原  49-50
    2.2.3 坎尼扎罗反应  50
  2.3 材料与方法  50-52
    2.3.1 材料  50
    2.3.2 方法  50-52
      2.3.2.1 还原反应  51
      2.3.2.2 产物分离  51-52
  2.4 产物分析  52
  参考文献  52-53
  附录  53-60
第三章微生物法还原氯代苯乙酮类化合物制备手性醇  60-74
  3.1 引言  60-61
  3.2 材料与方法  61-68
    3.2.1 材料  61-62
      3.2.1.1 菌种  61
      3.2.1.2 培养基  61
      3.2.1.3 试剂  61-62
      3.2.1.4 仪器与设备  62
    3.2.2 实验方法  62-68
      3.2.2.1 菌体培养  62
      3.2.2.2 还原反应  62
      3.2.2.3 分析方法  62-67
      3.2.2.4 数据处理方法  67-68
  3.3 结果与讨论  68-71
    3.3.1 菌种筛选  68
    3.3.2 氯代苯乙酮类化合物在缓冲液中的还原  68-70
    3.3.3 氯代苯乙酮类化合物在酵母培养液中的还原  70-71
  3.4 结论  71-72
  参考文献  72-74
第四章微生物法还原2’-氯-苯乙酮制备手性药物中间体  74-89
  4.1 引言  74
  4.2 微生物法还原2’-氯-苯乙酮制备R-2’-氯-1-苯乙醇的研究  74-87
    4.2.1 材料与方法  75
      4.2.1.1 菌种及培养基  75
      4.2.1.2 试剂  75
      4.2.1.3 仪器与设备  75
      4.2.1.4 菌体培养  75
      4.2.1.5 还原反应  75
      4.2.1.6 分析及数据处理方法  75
    4.2.2 结果与讨论  75-87
      4.2.2.1 具有还原能力菌种的选择  75-77
      4.2.2.2 辅助底物的种类及添加量对产率的影响  77-80
      4.2.2.3 S.cerevisiae B5还原2’-氯-苯乙酮的时间进程  80
      4.2.2.4 S.cerevisiae B5细胞的重复使用  80-82
      4.2.2.5 S.cerevisiae B5培养条件及还原反应通气量的影响  82-83
      4.2.2.6 S.cerevisiae B5细胞用量对还原产率的影响  83
      4.2.2.7 底物量对还原产率的影响  83-85
      4.2.2.8 反应溶液pH对产率的影响  85-86
      4.2.2.9 反应温度对还原产率的影响  86
      4.2.2.10 分批加入2’-氯-苯乙酮的结果  86-87
      4.2.2.11 乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶对2’-氯-苯乙酮的还原能力  87
      4.2.2.12 产物抑制的判断  87
  4.3 结论  87-88
  参考文献  88-89
第五章微生物法还原3-氯-1-苯丙酮制备手性药物中间体  89-106
  5.1 引言  89-92
    5.1.1 氟西汀简介  90-91
    5.1.2 托莫西汀(Tomoxetine)简介  91
    5.1.3 微生物法不对称还原3-氯-1-苯丙酮的研究  91-92
  5.2 材料与方法  92
    5.2.1 菌种及培养基  92
    5.2.2 试剂  92
    5.2.3 仪器与设备  92
    5.2.4 实验方法  92
      5.2.4.1 菌体培养  92
      5.2.4.2 还原反应  92
    5.2.5 分析方法  92
    5.2.6 数据处理方法  92
  5.3 结果与讨论  92-103
    5.3.1 菌种的筛选  92-94
    5.3.2 辅助底物对S.cerevisiae B5和C.pseudotropicalis 104还原3-氯-1-苯丙酮的影响  94-97
    5.3.3 最佳还原反应时间  97-98
    5.3.4 还原反应温度对产物产率的影响  98
    5.3.5 还原反应pH值对产物产率的影响  98-99
    5.3.6 微生物量对还原产物产率的影响  99-100
    5.3.7 底物量对还原产物产率的影响  100
    5.3.8 微生物的培养条件及反应条件对还原反应的影响  100-101
    5.3.9 还原反应中微生物的重复利用  101-102
    5.3.10 分批加入3-氯-1-苯丙酮的结果  102-103
    5.3.11 乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶对3-氯-1-苯丙酮的还原能力  103
  5.4 结论  103-104
  参考文献  104-106
第六章伴有辅酶再生过程的S.cerevisiae B5还原2’-氯-苯乙酮的催化反应机理和动力学参考文献  106-131
  6.1 引言  106
  6.2 动力学模型的建立  106-112
    6.2.1 反应机理  106-107
    6.2.2 模型的推导  107-112
  6.3 材料与方法  112-117
    6.3.1 材料  112-113
      6.3.1.1 菌种  112
      6.3.1.2 培养基:  112
      6.3.1.3 试剂  112
      6.3.1.4 仪器与设备  112-113
    6.3.2 实验方法  113-117
      6.3.2.1 菌体培养  113
      6.3.2.2 休止细胞生物还原反应  113
      6.3.2.3 细胞破碎  113
      6.3.2.4 分析方法  113-117
  6.4 生物转化过程中胞内辅酶含量的测定结果  117-121
    6.4.1 辅酶Ⅰ与辅酶Ⅱ标准曲线的测定结果  117
    6.4.2 反应过程中辅酶含量的测定结果  117-121
      6.4.2.1 底物初始浓度对细胞内NADH含量变化的影响  118
      6.4.2.2 底物初始浓度对NAD~+含量随反应时间的变化  118-119
      6.4.2.3 底物初始浓度不同时NADPH含量随反应时间的变化  119-120
      6.4.2.4 底物初始浓度不同时NADP~+含量随反应时间的变化  120-121
  6.5 反应动力学模型的应用  121-129
    6.5.1 从实验数据模型拟合参数  121-122
    6.5.2 实验数据与模型计算数据的比较  122-126
    6.5.3 底物浓度和反应速度随时间变化的情况  126-128
    6.5.4 反应速度随着NADH的浓度和底物的浓度的变化情况  128-129
  6.6 结论  129-130
  符号说明  130
  参考文献  130-131
第七章水／有机相两相体系中S.cerevisiae B5催化2’-氯-苯乙酮不对称还原的研究  131-139
  7.1 引言  131-133
  7.2 实验材料与方法  133-134
    7.2.1 材料  133
      7.2.1.1 菌种  133
      7.2.1.2 培养基  133
      7.2.1.3 试剂  133
      7.2.1.4 仪器与设备  133
    7.2.2 实验方法  133-134
      7.2.2.1 菌体培养  133-134
      7.2.2.2 还原反应  134
      7.2.2.3 分析方法  134
      7.2.2.4 活力倍数的计算方法  134
  7.3 结果与讨论  134-137
    7.3.1 有机溶剂对细胞活性的影响  134-135
    7.3.2 活力倍数和溶剂疏水性的关系  135-136
    7.3.3 水／十二烷两相体系中十二烷含量对2’-氯-苯乙酮还原产率的影响  136-137
    7.3.4 水／十二烷两相体系中S.cerevisiae B5还原2’-氯-苯乙酮的时间进程  137
  7.4 结论  137
  参考文献  137-139
致谢  139-140

微生物法还原羰基化合物制备手性药物中间体的研究

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