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红球菌P450硫醚单加氧酶的克隆表征及应用研究

作　者: 张建栋
导　师: 许建和
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 红球菌硫醚亚砜化克隆 P450单加氧酶葡萄糖脱氢酶辅酶再生
分类号: Q814
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

光学纯的亚砜化合物具有重要的应用价值,广泛被用作手性辅剂,手性催化剂及配体和手性药物。与动力学拆分外消旋亚砜相比,不对称氧化潜手性硫醚是合成光学纯亚砜最直接最经济的方法。生物催化法(微生物整细胞或酶)由于立体专一性强,反应条件温和,无毒,不会造成环境污染,受到广大研究者的重视。本课题从实验室筛选到的一株能不对称氧化硫醚生成亚砜菌株ECU0066入手,对其种属进行了鉴定。接着对该菌种中催化硫醚氧化相关酶进行了考察。通过多序列比对设计简并引物,从该菌基因组中成功克隆得到了一段新的P450单加氧酶基因序列,染色体步移得到了该酶的全长序列。对该P450单加氧酶在大肠杆菌中进行了高效表达、纯化、表征。进一步对酶的表达条件进行了优化,利用重组菌整细胞对硫醚进行了不对称氧化。由于该酶在反应过程中需要辅酶NADPH,所以我们从一株枯草芽孢杆菌中克隆得到一个葡萄糖脱氢酶(GDH)基因序列并在大肠杆菌中进行高效表达,在体外构建了GDH和P450单加氧酶偶联的反应体系,使辅酶得到了有效再生。最后将GDH和P450单加氧酶在大肠杆菌中进行了共表达,考察了体内辅酶再生对硫醚转化的影响。首先,对分离得到的能催化硫醚不对称氧化的菌株ECU0066进行了鉴定,通过菌落形态特征和16S rDNA序列比对,确定该菌株为红球菌(Rhodococcus sp.)。对红球菌催化特性进行分析,发现高对映选择性除了来自于硫醚的不对称氧化,随后的动力学拆分(通过氧化另一构型的亚砜为砜),使产物亚砜的对映选择性进一步提高至99%ee。在红球菌培养的指数期前期加入各种有机化合物对红球菌进行诱导,发现萘和硫醚对红球菌催化硫醚氧化的活性具有明显的诱导作用,经过诱导的细胞的酶活是未诱导的20倍以上,产物ee仍保持在99%以上。在红球菌整细胞反应体系中加入咪唑,发现其对红球菌整细胞的酶活具有明显抑制作用,证明其细胞内存在的P450单加氧酶对硫醚具有催化活性。其次,对红球菌中的硫醚氧化酶进行了克隆,通过保守序列设计的简并引物从该菌中成功克隆得到了一段新的P450单加氧酶基因,通过染色体步移技术获得了编码该酶的全长基因序列(2361 bp),主要编码786个氨基酸。基因序列分析发现该酶属于CYP116B家族的单加氧酶,与P450RHF同源性有73%。蛋白质一级结构分析发现该酶由FMN还原酶与铁氧还蛋白和亚铁血红素部分融合在一起,是一种自给自足(self-sufficient)类型的P450单加氧酶(简写为P450SMO)。将P450SMO与pET系列载体连接转化大肠杆菌后进行表达,通过重组菌整细胞的酶活定性检测,发现P450SMO对硫醚具有明显活性,产物ee高达99%。通过镍柱对酶进行纯化,得到了该酶的纯酶,对纯酶的性质进行了表征,结果显示：P450SMO具有典型的P450酶系光谱特征；咪唑对酶活具有明显的抑制作用；P450SMO反应的最佳温度为30℃,最佳pH为7.0；对酶的热稳定性分析表明该酶稳定性较差,在较高的温度下迅速失活。对酶的底物谱进行分析,发现其对所测试的硫醚底物具有较高的活性和立体选择性,生成的亚砜产物主要为S-构型,ee在80%-99%之间,反应过程中没有砜生成。在所有测试的硫醚中,以对氯苯甲硫醚的活性最高,产物亚砜的ee高达99%。同时还发现P450SMO能催化7-乙氧基香豆素脱烃生成7-羟基香豆素。再次,通过摇瓶培养,对重组菌P450SMO的表达条件进行了优化,考察了诱导温度、诱导剂(IPTG)量、诱导时期、诱导时间对P450SMO表达的影响,结果表明较低的诱导温度(25℃),较长诱导时间(18 h)可以有效增加酶的表达量,诱导期间加入一定量的三价铁离子可进一步提高酶的表达。经过摇瓶优化后P450SMO的表达量达到298nmol/L。在此基础上,在5L的发酵罐中对重组菌P450SMO酶的发酵进行了扩大培养,当以甘油为碳源,通过控制溶氧(小于10%),使P450SMO的表达量增加到近400nmol/L,重组菌比活力达到1.50 U/g DCW (dry cell weight)。进一步利用发酵得到的重组菌整细胞对硫醚进行了不对称氧化,优化了反应条件,在反应温度300C,pH 7.5,底物浓度150mg/L,1% DMSO作为助溶剂,葡萄糖浓度10 mM,反应12 h,转化率达到90%以上,最终得到130 mg/L的S-对氯苯甲亚砜,ee>98%。P450SMO在反应过程中需要辅酶NADPH,但是NADPH的价格非常昂贵,导致P450SMO的应用受到了一定的限制。为降低其应用成本,本文从一株枯草芽孢杆菌中克隆得到了一个葡萄糖脱氢酶(gdh)基因序列(786 bp),编码261个氨基酸。将GDH在大肠杆菌中进行了高效表达,酶活在没有优化的条件下达到5 U/mL。将表达得到的葡萄糖脱氢酶应用于体外构建的P450SMO和GDH偶联的催化反应体系中,对底物对氯苯甲硫醚进行不对称转化,结果体系中辅酶得到有效再生,底物转化率也大大提高,在底物浓度为1 mM,反应12h后,转化率达到90%以上,产物对映选择性大于98%ee。最后,本文采用P450SMO和GDH在宿主菌中共表达的策略,成功构建了三种P450SMO和GDH共表达系统,其中效果最好的系统为BL21 (pET28a-P450SMO-GDH),该系统P450SMO在表达量和整细胞转化硫醚的效果上均高于其它两种系统。在此基础上,对重组菌BL21(pET28a-P450SMO-GDH)的表达条件进行了优化,在诱导温度25℃,诱导时期OD6000.6,诱导剂IPTG 0.5 mM,诱导时间16h条件下,整细胞酶的比活达到2.2 U/g DCW。在底物浓度为2 mM,反应12h转化率可达100%,产物对映选择性大于98%ee。进一步将反应体系放大至100 mL,对750 mg/L的底物进行不对称氧化,结果反应12 h后产物得率达到53%。P450SMO与GDH在宿主菌中的共表达,使反应过程中辅酶在细胞内可以得到不断的再生,从而弥补了重组菌整细胞内NADPH不足的缺陷,进一步提高了反应转化效率。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第1章文献综述  14-32
  1.1 手性化合物简介  14-15
  1.2 手性亚砜类化合物  15-17
    1.2.1 手性亚砜类化合物简介  15-16
    1.2.2 手性亚砜类化合物的用途  16-17
  1.3 手性亚砜类化合物的生物合成途径  17-24
    1.3.1 酶催化硫醚不对称氧化  17-22
    1.3.2 微生物整细胞催化硫醚不对称氧化  22-23
    1.3.3 抗体催化亚砜化  23-24
  1.4 细胞色素P450单加氧酶  24-29
    1.4.1 细胞色素P450单加氧酶催化的反应及其机制  24-26
    1.4.2 细胞色素P450单加氧酶的分类  26-27
    1.4.3 细胞色素P450单加氧酶的应用  27-29
  1.5 P450单加氧酶反应过程中辅酶再生  29-30
    1.5.1 电化学法再生  29-30
    1.5.2 酶偶联再生  30
    1.5.3 其它再生方法  30
  1.6 本课题主要研究目的及意义  30-31
  1.7 本论文主要研究内容  31-32
第2章硫醚单加氧酶产生菌株的鉴定及其催化特性  32-44
  2.1 前言  32
  2.2 实验材料  32-33
    2.2.1 药品和试剂  32-33
    2.2.2 主要仪器设备及分析软件  33
    2.2.3 菌株与培养基  33
    2.2.4 抗生素的配制  33
  2.3 实验方法  33-36
    2.3.1 菌种的筛选  33-34
    2.3.2 ECU0066菌落形态特征  34
    2.3.3 ECU0066菌株基因组DNA的提取  34
    2.3.4 PCR扩增16S rDNA  34-35
    2.3.5 T-A克隆及蓝白斑筛选  35
    2.3.6 重组质粒的鉴定及外源基因的测序  35
    2.3.7 序列分析及数据处理  35-36
  2.4 实验结果  36-42
    2.4.1 菌种筛选  36
    2.4.2 菌落特征  36-37
    2.4.3 基因组DNA提取  37
    2.4.4 16S rDNA PCR扩增及其鉴定  37-38
    2.4.5 16S rDNA基因序列的测序及系统发育分析  38-39
    2.4.6 ECU0066催化硫醚生成亚砜的特征  39-40
    2.4.7 ECU0066催化硫醚生成亚砜的诱导与抑制  40-42
    2.4.8 ECU0066对其它化合物的转化  42
  2.5 讨论  42-43
  2.6 小结  43-44
第3章红球菌中硫醚单加氧酶基因的克隆及其序列分析  44-59
  3.1 前言  44
  3.2 实验材料  44-45
    3.2.1 药品与试剂  44
    3.2.2 菌株与培养基  44
    3.2.3 引物合成  44-45
    3.2.4 主要仪器设备及分析软件  45
  3.3 实验方法  45-48
    3.3.1 引物设计  45-46
    3.3.2 目的基因保守序列的PCR扩增  46
    3.3.3 染色体步移  46-48
    3.3.4 序列分析及数据处理  48
  3.4 实验结果  48-57
    3.4.1 保守序列PCR扩增结果  48-49
    3.4.2 染色体步移扩增未知序列  49-53
    3.4.3 序列分析  53-57
  3.5 讨论  57-58
  3.6 小结  58-59
第4章 P450SMO在大肠杆菌中的表达、纯化及其性质  59-85
  4.1 前言  59
  4.2 实验材料  59-60
    4.2.1 工具酶与化学试剂  59
    4.2.2 菌株与质粒载体  59-60
    4.2.3 培养基  60
    4.2.4 主要实验仪器和设备  60
  4.3 实验方法  60-64
    4.3.1 引物设计与P450SMO的克隆  60-61
    4.3.2 表达载体构建  61
    4.3.3 重组菌的培养及酶的诱导表达  61-62
    4.3.4 重组菌整细胞对硫醚转化  62
    4.3.5 重组P450SMO的纯化  62
    4.3.6 P450SMO的理化性质  62-63
    4.3.7 重组菌表达条件的优化  63-64
  4.4 实验结果  64-82
    4.4.1 重组质粒的构建  64-66
    4.4.2 重组蛋白的表达  66
    4.4.3 重组菌酶活定性检测  66-67
    4.4.4 P450SMO的纯化及其性质表征  67-70
    4.4.5 P450SMO对不同硫醚底物的转化  70-71
    4.4.6 P450SMO对7-乙氧基香豆素的脱烃活性  71-72
    4.4.7 重组菌表达条件的优化  72-78
    4.4.8 重组菌整细胞反应条件优化  78-81
    4.4.9 重组菌整细胞对对氯苯甲硫醚的不对称氧化  81-82
  4.5 讨论  82-83
  4.6 小结  83-85
第5章 P450SM0辅酶再生体系的构建及其用于硫醚不对称氧化研究  85-112
  5.1 前言  85-86
  5.2 实验材料  86-87
    5.2.1 药品与试剂  86
    5.2.2 质粒与菌株  86
    5.2.3 主要仪器与设备  86-87
    5.2.4 引物合成  87
  5.3 实验方法  87-94
    5.3.1 枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的克隆与表达  87-89
    5.3.2 葡萄糖脱氢酶活力测定  89
    5.3.3 葡萄糖脱氢酶用于体外P450SMO催化过程中辅酶再生  89
    5.3.4 P450SMO与GDH共表达体系的构建  89-94
    5.3.5 重组菌整细胞转化  94
  5.4 实验结果  94-110
    5.4.1 枯草芽孢杆菌中葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的克隆  94-95
    5.4.2 葡萄糖脱氢酶表达载体的构建  95-96
    5.4.3 葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中高效表达  96-97
    5.4.4 不同浓度辅酶NADPH对P450SMO转化硫醚的影响  97-98
    5.4.5 P450SMO不同反应体系对硫醚转化  98-99
    5.4.6 体外双酶偶联体系不对称转化硫醚  99-100
    5.4.7 重组菌整细胞共表达体系的构建  100-105
    5.4.8 重组大肠杆菌BL21(pET28a-P450SMO-GDH)表达条件的优化  105-108
    5.4.9 重组菌BL21(pET28a-P450SMO-GDH)在硫醚转化过程中辅酶再生作用  108-109
    5.4.10 重组菌BL21(pET28a-P450SMO-GDH)对对氯苯甲硫醚的转化  109-110
  5.5 讨论  110-111
  5.6 小结  111-112
结论与展望  112-115
参考文献  115-131
附录  131-137
攻读博士学位期间撰写的论文和专利  137-138
致谢  138-139
卷内备考表  139

红球菌P450硫醚单加氧酶的克隆表征及应用研究

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