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胞嘧啶脱氨酶自杀基因治疗大肠癌的实验研究

作　者: 沈历宗
导　师: 武正炎；吴文溪
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 大肠癌基因治疗自杀基因胞嘧啶脱氨酶基因腺病毒载体癌胚抗原组织或细胞特异性启动子免疫基因治疗 IL-2基因 INF-γ基因化学药物顺铂丝裂霉素C 细胞凋亡流式细胞术旁观者效应远距离旁观者效应裸鼠
分类号: R735.34
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

1 含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用目的建立癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）基因启动子驱动的含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（E．Coli. cytosine deaminase，EC-CD）自杀基因的重组腺病毒载体AdCEACD，研究CEA启动子控制EC-CD基因在CEA阳性的细胞中专一性表达并专一性杀伤的可行性。方法采用同源重组法在293细胞中重组腺病毒，用点杂交、PCR法进行鉴定，用CsCl密度梯度超离心法纯化病毒，用空斑形成试验进行病毒滴度测定。以由巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）启动子驱动EC-CD基因的重组腺病毒载体AdCMVCD为参照。体外分别感染CEA阳性（Lovo、HCT1116BG细胞）和CEA阴性（Hela、CT26细胞）细胞，用MTT法检测受染细胞5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）的敏感性，并计算半数杀伤浓度（fifty percent inhibition concentration，IC50）；用RT-PCR法检测受染细胞EC-CD基因mRNA的表达。用Lovo、CT26细胞接种Balb／c nu／nu裸鼠皮下制成动物模型，瘤内接种病毒载体，腹腔给予5-FC，治疗结束测量肿瘤体积；测定不同治疗组鼠外周血谷丙转氨酶与谷草转氨酶（ALT与AST）；并取鼠股骨骨髓涂片行瑞氏染色，观察骨髓增殖情况。结果鉴定显示重组腺病毒中含有CEA基因及EC-CD基因，纯化后滴度可以达到5.0×10¹¹pfu／ml，CEA阴性的Hela、CT26细胞感染AdCMVCD后对5-FC敏感性增强，IC50明显降低（p＜0.01），而感染AdCEACD后不能被5-FC杀伤；CEA阳性的Lovo、HCT1116BG细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性，均对5-FC敏感，IC50均明显降低（p＜0.01）。AdCEACD／5-FC系统有明显的旁观者效应，当受染细胞比例仅为10％时，细胞存活率约为30％。RT-PCR检测显示Lovo细胞感染AdCEACD及AdCMVCD后均可检测到EC-CD mRNA表达；Hela细胞感染AdCMVCD后可以检测到EC-CD mRNA表达，但在AdCEACD感染后则没有EC-CD 南京医科大学博士学位论文mRNA表达。在 LoVO细J解鼠实验中，娜 AdCMVCD或 AdCEACD后，给予前药 5IC，］摘生长均明则中制中对．01)；在 Ch6细赠鼠实验中，接种 AdCMVCD kr予前药 5－FC，j殖生长亦明显抑制（仰．of），6在接种AdC矾CD gjb予 5－FC后顺生长敞明显影响。Lnvo细B解鼠实验中单用5FC或单用AdC一、AdCMVCD、AdCEACD等病毒对裸鼠ALT、AST M明显影响，邮同时树5几组，ALT、AS T均有不同程度增力。Lovo细月解鼠实验中巩理红u叉AdCEACD／5FC治疗组骨姚生明显活跃，而AdC MVC D／5IC治疗懈鼠骨姚生活民与前两者相L匕骨雕生明显受抑。鳅本实验建立的C巩启动于驱动的含ECcD 自杀基因的腺病毒载体A丸EAC D，s眼EC－CD基因专一性地在C以阳性细胞中表达，银专一性杀伤作用。与AdCMV D比较，AdC EAC D对动物骨朝一定的防作用。该载体基本站q实马幼女子十要求，有助于实测 CEA阳性肿瘤的靶向性自杀基因治疗。二胞感喷出铅印海基因用一刍IL－2、Dw什基因治疗大J防癌目的研究胞喀淀脱氨酶基因（ECCD）懈fiE、e’一性＠对蛐癌的治疗作用。方法分别以重组腺病毒狲AdC MVC D、AdC EAC D溺EC－CD基因；AdCMVflM电转导人 n上基因；AdCMVIN’F介树鼠 INF个基因。分别在体外、内（B撇＂u／nU裸眼 B测，J、鼠）晌 EC－CD基因一 IL－2基因对Lov细脚贿、以及EC －CD基因鹏鼠o：F个基因对CD6细B附瘤的治疗作用。体内联合疗结述或中瘤行常规HE染色进行组织学检查。结果 LoV细月响 C126细胞分另IJ受 AdCMVIL七、AdC… Y感射细B旺长受到比较明助制。鹏AdC MVIN’F－Y可以增强AdCMVCD／FC对Cn6细胞的杀伤作用，ICSO明显变小（问．卿1），B贿生长明显抑制中旬对见)。懈AdC MVn2亦增强AdC EAC孤FC对LoV细胞的细胞村用（问．05），肿瘤生长亦明别叩制（叼．000），用y个疗的效果与单用A优MVC D／5－FC鞭。组织派查显示m毛D基因与D－2、M裕固鹏治疗组肿瘤内有大饼巴细胞浸润，助小鼠B惋b解鼠B贴中更明显。 3 南京医科大学博士学位论文规故LZ或M仅因可以明显增强m毛D基因中瘤加，且可V弥q除向性附治疗效率较差的缺点。局部淋巴细B吸润增加可5脚卜定作用。3is．M＊AnwiAn因联合化学药物治疗大肠癌目的研究鹏一因（ECCD）联合化学药物对蛐癌的治疗作用。方法以重娜病毒AdCMVCD为载体转导EC－CD基因，化学药物阈．顷铂（中l咖，CDm）及丝辩素 C（d一体 C，MMC）。体夕卜究化学药物对AdC MV C孤一W系统撤杀伤作用及旁胀加的影响。以LoVO细胞Blb／m加州裸鼠皮下移鹏为例，研究懈EC－CD基因与化学药物对蛐癌的治疗作用，并用流或细胞树测治疗后肿瘤中凋亡细胞比例。结果病毒感染并不影响LoVO细则CDD P、WC的雅性；低剂量CDDP、MMC即可明显增强AdCMVC孤儿系统的就杀瘤作用，5－FC对 LoVO细胞的 IC。p000州，当

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目录  3-4
中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
前言  13-17
第一章基本实验技术和方法  17-26
第二章含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用  26-54
第三章胞嘧啶脱氨酶基因联合IL-2、INF-γ基因治疗大肠癌  54-69
第四章胞嘧啶脱氨酶基因联合化学药物治疗大肠癌  69-83
第五章胞嘧啶脱氨酶基因的旁观者效应与宿主免疫状态有关  83-97
附录1 常用自杀基因系统  97-101
附录2 主要缩略语对照  101-102
附件1 在读博士期间发表论文目录、参编书籍及参加学术会议情况  102-104
附件2 在读博士期间负责和参与课题  104-105
附件3 在读博士期间获奖情况  105-106
综述基因治疗靶向技术研究进展  106-125
致谢  125

胞嘧啶脱氨酶自杀基因治疗大肠癌的实验研究

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