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ALI/ARDS治疗的新途径：肾素-血管紧张素系统

作　者: 沈利汉
导　师: 肖正伦；孔天翰
学　校: 广州医学院
专　业: 呼吸内科学
关键词: ALI/ARDS CLP ALI RAS AngⅡ ACE ACE2 MAPK NF-κB 信号传导细胞凋亡氯沙坦
分类号: R563.8
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的由于目前尚无特异有效的治疗方法,急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)的死亡率一直居高不下。最近,肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)引起关注,有证据提示RAS与ALI/ARDS存在重要关联。为系统研究RAS与ALI/ARDS的关系,我们首先建立盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture,CLP)诱导的ALI/ARDS动物模型,以观察ALI/ARDS中RAS系统的变化规律,并通过干预RAS系统观察动物病情和预后的改变;在此基础上,进一步研究RAS药物氯沙坦干预ALI/ARDS炎症反应通路的机制;同时,还观察ALI/ARDS模型的血管内皮细胞超微结构,并在体外实验验证氯沙坦干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的作用。期望通过这一系列的实验,为ALI/ARDS治疗探索新的途径。研究内容和方法第一部分: ALI/ARDS动物模型中RAS系统的变化建立CLP诱导的ALI/ARDS动物模型,在手术后18小时观察小鼠的症状、血气分析、肺湿/干重比(W/D)和肺组织病理等指标;采用免疫组织化学、蛋白质免疫印迹法(Western blotting)和放射免疫等方法研究ALI/ARDS动物模型中RAS系统几种关键酶(ACE、ACE2和AngⅡ)的变化规律。第二部分:RAS药物对ALI/ARDS的影响小鼠ALI/ARDS模型复制成功后,分别给小鼠腹腔注射卡托普利(ACE拮抗剂)、重组小鼠ACE2(recombinant mouse ACE2,rm ACE2)和氯沙坦(AngⅡ的AT1受体阻滞剂),观察它们对ALI/ARDS动物的影响,在此基础上,着重观察RAS下游阻滞剂氯沙坦对ALI/ARDS的治疗效果。第三部分:氯沙坦治疗ALI/ARDS的可能机制收集假手术组、手术组和氯沙坦组的小鼠肺组织,分别提取肺组织细胞胞浆蛋白和胞核蛋白,采用Western blotting方法检测胞浆IκB-α表达的变化,采用电泳迁移率变动分析实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)检测胞核中NF-κB的表达变化;另外提取肺组织总蛋白,采用Western blotting方法检测肺组织中丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的变化(包括ERK1/2、p38和JNK)。第四部分:氯沙坦对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响先用透视电镜观察ALI/ARDS肺血管内皮细胞的变化,提示ALI/ARDS病理变化中存在血管内皮细胞的变化;在此基础上,在体外培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC),培养成功后先用AngⅡ刺激细胞,采用流式细胞术观察细胞的凋亡率;然后再加入氯沙坦与AngⅡ共同作用于HUVEC,再次测定细胞的凋亡率,评价氯沙坦对血管内皮细胞的保护作用。研究结果第一部分: ALI/ARDS动物模型中RAS系统的变化1、CLP能够诱导小鼠在手术后18小时出现典型的ALI/ARDS改变,手术组较假手术组小鼠肺水含量明显增多(W/D:6.08±0.64 vs 4.38±0.93,P<0.01),明显缺氧(PaO2:40.8±5.03 vs 72.8±4.32,P<0.01),氧合指数明显下降(PaO2/FiO2:194.3±23.9 vs 346.7±20.5,P<0.01),且肺组织病理出现明显的肺损伤改变。2、Western blotting和免疫组化的结果显示,与假手术组比较,ALI/ARDS小鼠肺组织的ACE2表达下降;而ACE则没有明显差异,手术组和假手术组肺组织中ACE蛋白量均很高。3、在ALI/ARDS小鼠肺组织和血浆中AngⅡ的量均明显增高,而且加入相关RAS药物后AngⅡ出现变化;与手术组比较,卡托普利(ACE拮抗剂)和rmACE2(重组小鼠ACE2)都能不同程度的抑制体内AngⅡ的生成(肺,1.58±0.16,1.65±0.21 vs 2.38±0.41;血,178.04±17.87,153.74±10.24 vs 213.38±25.44)。第二部分:RAS药物对ALI/ARDS的影响1、与手术组比较,卡托普利组小鼠肺W/D明显降低(5.35±0.25 vs 6.06±0.22,P﹤0.05),rmACE2组与手术组的W/D比较虽然无明显统计学差异,但也出现下降趋势(5.61±0.59 vs 6.06±0.22,P=0.096)。相比而言,氯沙坦能更显著的减少ALI/ARDS小鼠肺W/D (5.35±0.25 vs 6.06±0.22,P﹤0.01)。2、氯沙坦改善肺损伤的程度是与其浓度有关的,在5mg/kg至15mg/kg的范围内,ALI/ARDS小鼠的氧合指数和W/D均得到改善,其改善程度随氯沙坦的浓度增加而增加,但当氯沙坦的浓度超过15mg/kg时,氧合指数和W/D反而逐渐变差,氯沙坦浓度为15mg/kg时治疗ALI/ARDS效果最好。3、氯沙坦能抑制ALI/ARDS小鼠血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达,减轻肺损伤,且能一定程度的改善小鼠7天生存率。第三部分:氯沙坦治疗ALI/ARDS的可能机制1、CLP手术诱导的ALI/ARDS小鼠肺组织胞浆中的IκB-α减少,而胞核NF-κB表达明显增强;腹腔注射氯沙坦后,小鼠IκB-α降解程度减少,相应的,细胞核活化的NF-κB也减少了。2、在CLP手术诱导的ALI/ARDS小鼠肺组织中,ERK1/2、JNK和p38的磷酸化明显增强,而增加氯沙坦后MAPK磷酸化得到不同程度的抑制。第四部分:氯沙坦对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响1、CLP诱导的ALI/ARDS小鼠肺血管内皮细胞出现水肿或溶解,核周间隙分离增宽,内皮细胞间连接增宽。2、人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)加入AngⅡ刺激24小时后,细胞凋亡呈浓度依赖型,AngⅡ(10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l)的细胞凋亡率分别是7.85%、9.96%和10.4%。加入10-6mol/l氯沙坦后,HUVEC凋亡率得到改善,细胞凋亡率分别变为:7.95%、8.62%、8.67%。结论1、CLP诱导的ALI/ARDS存在RAS系统激活,表现为机体AngⅡ含量明显增加。2、RAS系统中ACE和ACE2对AngⅡ生成有不同的调节作用,ACE起正调节作用而ACE2起负调节作用;卡托普利和rmACE2都能在一定程度上减少AngⅡ的分泌,改善肺损伤。3、AngⅡ的AT1受体阻滞剂氯沙坦能够明显改善CLP诱导的ALI/ARDS症状,减轻肺损伤,并能提高7天生存率。4、氯沙坦治疗ALI/ARDS的可能机制:干预NF-κB和MAPK信号通路,减轻ALI/ARDS的全身性炎症反应。5、CLP诱导的ALI/ARDS小鼠出现血管内皮细胞损伤;氯沙坦可能通过影响血管内皮细胞的凋亡,减轻血管渗透性,发挥其治疗ALI/ARDS的作用。6、肾素-血管紧张素系统可能是治疗ALI/ARDS的新途径。

全文目录

英文缩略语表  3-5
中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
前言  14-16
第一部分：ALI/ARDS 的学位论文">ALI/ARDS 动物模型中 RAS 系统的变化  16-30
  材料与方法  16-25
  结果  25-27
  讨论  27-30
第二部分：RAS 药物对 ALI/ARDS 的影响  30-39
  材料与方法  30-34
  结果  34-36
  讨论  36-39
第三部分：氯沙坦治疗 ALI/ARDS 的可能机制  39-49
  材料与方法  39-45
  结果  45-46
  讨论  46-49
第四部分：氯沙坦对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响  49-57
  材料与方法  49-53
  结果  53-55
  讨论  55-57
结论  57-58
附图  58-73
参考文献  73-88
在校期间发表文章  88-89
致谢  89-90

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