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IL-12真核表达质粒构建及其瘤苗抗肺癌免疫作用研究

作　者: 尹晓玲
导　师: 李少林
学　校: 重庆医科大学
专　业: 药理学
关键词: IL-12瘤苗抗肺癌单克隆抗体1E2 动物模型
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:构建能在真核细胞内稳定表达小鼠白介素-12(murine interleukin- 12 , mIL-12)的重组质粒,建立稳定表达小鼠IL-12的小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞系LLC/ mIL-12,评估mIL-12重组质粒及LLC/ mIL-12瘤苗治疗小鼠Lewis肺癌移植瘤的疗效及LLC/ mIL-12瘤苗对荷Lewis肺癌小鼠的放疗增敏作用。分析碘-131(iodine,131I)标记抗肺癌单克隆抗体1E2在荷Lewis肺癌小鼠体内分布,评估瘤内注射131I标记单克隆抗体1E2(131I-1E2)对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用及IL-12瘤苗对131I-1E2抗体靶向治疗的增效作用。方法:通过PCR(Polymerase chain reaction,聚合酶链反应)扩增质粒pORF- mIL-12,双酶切后将目的片段mIL-12连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒上,mIL-12受pcDNA3.1(+)中小鼠巨细胞病毒(Mouse cytomegalovirus, CMV)启动子驱动,将mIL-12全长转录至同一mRNA上,对重组质粒进行鉴定后脂质体转染小鼠LLC细胞测IL-12表达。FCM(Flow cytometry,流式细胞仪)观察细胞周期和凋亡,G418筛选获得阳性克隆后检测LLC/mIL-12活性,大量培养获得IL-12瘤苗。于C57 BL/6小鼠右后肢皮下接种LLC细胞2×106个/只,成瘤后将小鼠随机分成4组(n=10),第1、4、7 d瘤内注射重组质粒或瘤苗,第14 d处死小鼠,观察肿瘤生长曲线、脾细胞CTL(Cytotoxic T lymphocyte,细胞毒T淋巴细胞)和NK(Natural killer,自然杀伤细胞)活性以及肿瘤浸润淋巴细胞。进行放疗增敏作用研究时,小鼠成瘤后随机分组,在第0、7、14 d瘤苗组和联合组瘤内注射瘤苗,第1、3、5 d放疗组和联合组给予2 Gy局部照射,对照组不作任何治疗。第21 d处死小鼠观察肿瘤体积、重量、脾细胞CTL和NK活性以及肿瘤细胞凋亡。取未治疗荷Lewis肺癌小鼠肿瘤组织,免疫组化检测LLC细胞膜上抗肺癌单克隆抗体1E2对应抗原—CPS-1(Carbamyl phosphate synthetase,氨甲酰磷酸合成酶)的表达。131I标记抗肺癌单克隆抗体1E2,检测标记率、放化纯度、放射性比活度。荷瘤小鼠尾静脉注射标记抗体131I-1E2 18.5 MBq,观察其不同时间点在小鼠体内的分布。成瘤后小鼠随机分成4组,第0,7,14 d分别瘤内注射生理盐水0.1ml(空白对照),1E2单抗3μg(阳性对照),131I-IgG 18.5 MBq(阴性对照),131I-1E2 18.5 MBq(实验组)。治疗后每周2次测定肿瘤大小,21 d后处死小鼠观察肿瘤组织病理学改变,检测肿瘤体积、重量,计算抑瘤率。为了观察IL-12瘤苗对131I-1E2抗体靶向治疗的增效作用,将mIL-12质粒转染LLC细胞,Na131I标记1E2抗体,C57BL/6小鼠右后肢皮下建立荷瘤鼠模型,成瘤后随机分成四组,分别予PBS、GT(Gene therapy,即IL-12瘤苗)、RIT(Radioimmunotherapy,放射免疫治疗)和GT+RIT(IL-12瘤苗+放射免疫治疗)进行治疗,测量肿瘤体积及重量,计算抑瘤率,检测CTL和NK活性。荷瘤小鼠尾静脉注射131I-1E2 18.5 MBq及瘤内注射IL-12瘤苗与单纯尾静脉注射标记抗体比较,分析标记抗体在小鼠体内的分布。结果:PCR成功扩增出mIL-12片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒构建成功,RT-PCR及ELISA证实重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12。mIL-12使LLC细胞周期重新分布,并促进其凋亡。LLC/ mIL-12细胞培养上清能诱导ConA(Concanavalin A,刀豆蛋白A)激活的小鼠脾细胞增殖。LLC/mIL-12和pcDNA3.1(+)-mIL-12治疗组肿瘤体积显著缩小,mIL-12能增强NK和CTL活性,两者均以LLC/ mIL-12治疗组作用更显著,且LLC/ mIL-12和pcDNA3.1(+)-mIL-12治疗组有大量CD4+、CD8+淋巴细胞浸润。放疗联合IL-12瘤苗组肿瘤体积显著缩小,NK和CTL活性增强,凋亡增加,与瘤苗组、对照组和放疗组相比,p<0.05;放疗组NK和CTL活性降低。1E2对应抗原CPS-1主要在肿瘤细胞膜表达,131I-1E2标记率为67.73%,放化纯度为95.63%。131I-1E2主要分布在肿瘤组织,治疗后3 w试验组肿瘤体积为0.946±0.153cm3,重量为1.802±0.194g,抑瘤率72.0%,与对照组间比较差异有统计学意义(p<0.01),对照组之间差异无统计学意义(p>0.05)。治疗组与对照组间病理学差异显著。IL-12瘤苗能使131I-1E2更多积聚在肿瘤组织而减少正常组织损伤,从而使放射免疫治疗剂量得以提高,而131I-1E2能增强IL-12基因治疗效果。结论:pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达质粒构建成功并能在LLC细胞中稳定表达,成功建立具有mIL-12生物学活性的LLC细胞系,LLC/ mIL-12及pcDNA3.1(+)-mIL-12均能产生抗瘤免疫反应,且前者作用更强。LLC/ mIL-12瘤苗及放疗均能产生抗瘤反应,且二者联合作用更强。瘤苗放疗增敏作用机制是诱导细胞凋亡,增强NK和CTL活性。131I-1E2瘤內注射可抑制肿瘤的生长，具有潜在的临床应用价值，有可能成为新的肿瘤靶向治疗药物。IL-12瘤苗能增强131I-1E2靶向治疗效果,而131I-1E2能增强IL-12基因治疗效果。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-15
论文正文：IL-12 真核表达质粒构建及其瘤苗抗肺癌免疫作用研究  15-85
  前言  15-20
  第一部分小鼠IL-12 真核表达质粒的构建及IL-12 瘤苗抗瘤作用研究  20-61
    第一节小鼠IL-12 真核表达质粒的构建及其在小鼠Lewis 肺癌细胞中的表达  20-34
      1 材料与方法  20-30
      2 结果  30-31
      3 讨论  31-33
      参考文献  33-34
    第二节建立稳定表达IL-12 的小鼠Lewis 肺癌细胞系及其活性检测  34-42
      1 材料与方法  34-37
      2 结果  37-39
      3 讨论  39-41
      参考文献  41-42
    第三节白介素-12 瘤苗抑瘤作用研究  42-55
      1 材料和方法  43-49
      2 结果  49-51
      3 讨论  51-53
      参考文献  53-55
    第四节 IL-12 瘤苗放疗增敏作用研究  55-61
      1 材料与方法  55-57
      2 结果  57-58
      3 讨论  58-60
      参考文献  60-61
  第二部分 I 标记抗肺癌单克隆抗体1E2 在荷瘤小鼠体内分布及对小鼠移植瘤作用  61-74
    1 材料与方法  61-66
    2 结果  66-68
    3 讨论  68-72
    参考文献  72-74
  第三部分 I 标记抗肺癌单克隆抗体1E2 与IL-12 瘤苗协同抗瘤作用研究  74-85
    1 材料和方法  74-79
    2 结果  79-80
    3 讨论  80-82
    参考文献  82-85
全文总结  85-88
附插图  88-98
文献综述：肺癌疫苗研究进展  98-107
  参考文献  104-107
致谢  107-108
攻读博士学位期间发表的学术论文及课题专利申请  108-109
攻读博士学位期间参加的学术活动及培训  109

IL-12真核表达质粒构建及其瘤苗抗肺癌免疫作用研究

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