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骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究

作　者: 郭嘉宁
导　师: 畅继武
学　校: 天津医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 间充质干细胞 胰岛细胞 共培养 免疫细胞化学染色 双硫腙染色
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：探讨胎儿骨髓间充质干细胞(BMSCs)在适当的条件下体外分化为胰岛样分泌细胞的可能性。内容：从20例流产的胎儿骨髓中分离,筛选并纯化骨髓间充质干细胞,通过流式细胞仪检测细胞表面标志(CD14, CD73, CD117, CD147)以及成脂肪诱导分化来证明其是否为间充质干细胞和是否具有干细胞分化的特性；同时收集胎儿的胰脏,用胎牛血清和脐血清两种不同血清的培养基分别培养,比较胰岛β细胞的生长、分泌情况并鉴定细胞;用Transwell共培养皿将骨髓间充质干细胞与脐血清培养的胰岛细胞共培养,倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞和胰岛细胞的形态变化并对分化的细胞进行鉴别。方法：1、从胎儿四肢骨中收集骨髓细胞,采用密度梯度离心和贴壁筛选培养法进行培养和纯化BMSCs。2、取生长良好的P3或p4代BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原标记和成脂肪细胞诱导分化等进行细胞检测。3.酶消化法分离胰岛,分别用胎牛血清和脐血清体外培养胰岛细胞,模拟胰岛生活的体外环境。并用化学方法双硫腙染色和电镜技术鉴定细胞。4、应用共培养的技术将骨髓间充质干细胞和胰岛细胞共培养,通过体外微环境诱导分化BMSCs并在倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态变化和用RAI技术检测诱导后3、6、9、12大胰岛素的分泌量,并用化学试剂双硫腙染色,免疫细胞化学和电镜等技术鉴定BMSCs的分化情况。结果：1、利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法分离人BMSCs,经传代后培养至3代以后细胞形态呈“水草”样梭形排列,均匀一致。流式细胞仪检测细胞的特异性表面标志物CD117、CD147、CD73表达阳性,CD14表达阴性,符合骨髓间充质干细胞的表而标志。成脂肪诱导后,由红O染包均呈阳性。2、脐血清培养的胎儿胰岛细胞的获得量是胎牛血清组的数倍,双硫腙染色脐血清组胰岛β细胞的纯度达75%以上。电镜检测无特殊差异,两组细胞中可见含有大量分泌颗粒的β细胞。3、未经诱导的BMSCs呈长梭形贴壁生长,与胰岛细胞共培养的BMSCs逐渐变圆,并聚集成团。共培养9天后,BMSCs经电镜观察有分化成熟的含分泌颗粒的分泌细胞；RAI检测分泌大量胰岛素,胰岛素释放量显著。DTZ染色为阳性,细胞免疫化学检测阳性。而对照组无胰岛素释放。结论：1、经过分离、培养成功地从人骨髓中分离获得纯度较高的BMSCS,在体外培养、增殖多代,该细胞具有自我更新及多向分化潜能,符合干细胞的特点。2、脐血清组培养的胰岛数量和质量较高,体外模拟了胰岛细胞生活的环境,为更好的实验奠定了基础。3、通过微环境的刺激,胎儿BMSCs能分化成胰岛素分泌细胞,为胰岛替代移植的成功打开了序幕。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语  10-11
前言  11-13
  研究现状、成果  11-12
  研究目的、方法  12-13
一、人胎骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养、鉴定  13-26
  1.1 材料和方法  13-19
    1.1.1 材料  13-15
    1.1.2 实验方法  15-19
  1.2 结果  19-23
    1.2.1 骨髓间充质干细胞的形态观察  19-20
    1.2.2 传代BMSCs的形态学变化  20-21
    1.2.3 BMSCs生长曲线  21
    1.2.4 BMSCs分裂指数曲线  21-22
    1.2.5 BMSCs流式鉴定结果  22
    1.2.6 BMSCs分化鉴定结果  22-23
  1.3 讨论  23-25
  1.4 小结  25-26
二、人胎胰岛细胞的分离、培养、鉴定  26-36
  2.1 材料和方法  26-29
    2.1.1 材料  26-28
    2.1.2 实验方法  28-29
  2.2 结果  29-33
    2.2.1 胰岛细胞的形态学观察  29-31
    2.2.2 人胎胰岛细胞的生长曲线  31-32
    2.2.3 培养上清胰岛素释放  32
    2.2.4 胰岛β细胞超微结构  32-33
  2.3 讨论  33-35
  2.4 小结  35-36
三、共培养骨髓间充质干细胞和胰岛细胞  36-49
  3.1 材料和方法  36-39
    3.1.1 材料  36-37
    3.1.2 实验方法  37-39
  3.2 结果  39-45
    3.2.1 胰岛β细胞的形态学观察  39-40
    3.2.2 BMSCs的形态学观察  40
    3.2.3 BMSCs与胰岛细胞共培养的形态学观察  40-42
    3.2.4 放射核素检测各孔胰岛素的分泌随时间的变化  42-43
    3.2.5 双硫腙染色  43
    3.2.6 共培养9天BMSCs的超微结构特点  43-44
    3.2.7 免疫细胞化学染色  44-45
  3.3 讨论  45-48
  3.4 小结  48-49
结论  49-50
参考文献  50-56
发表论文和参加科研情况说明  56-57
综述 间充质干细胞在Ⅰ型糖尿病治疗中的应用及鉴定  57-70
  综述参考文献  64-70
致谢  70-71

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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