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中华绒螯蟹（Eriocheir Sinensis）cDNA文库的构建、EST分析及其酚氧化酶系统关键基因的研究

作　者: 盖云超
导　师: 宋林生
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 中华绒螯蟹 cDNA文库 表达序列标签(EST) 固有免疫 鳗弧菌 酚氧化酶 实时定量PCR RNAi 酚氧化酶激活酶 丝氨酸蛋白酶抑制剂 调控机制
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国的特色物种,具有重要的经济和科研价值。酚氧化酶系统作为节肢动物特有的免疫机制,在中华绒螯蟹的免疫反应中发挥重要作用。本研究构建了一个中华绒螯蟹的cDNA文库,利用表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)技术,对中华绒螯蟹表达序列进行了大规模测序分析,并利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)、实时定量PCR、原核重组和RNAi等技术研究了其酚氧化酶免疫系统的分子基础及其相应功能。用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌同时感染中华绒螯蟹,提取血细胞的RNA构建了一个库容为3.3×106克隆cDNA文库。随机测序后获得7535条高质量的EST序列,其中在GenBank数据库中未发现同源序列的为4593条,而具有较高同源性2942条可以分为20个功能类别,参与了23个生物学反应。进一步分析发现,969条(32.9% )EST与免疫相关,可拼接成221个免疫基因。这个比例高于其它任何一个已公布的甲壳动物cDNA文库。在免疫相关EST中,抗菌肽比例最高,约占总数的20.1%(195条EST)。免疫基因的高比例和抗菌肽的高表达,证明细菌刺激是提高cDNA文库中免疫基因丰度的有效方法。EST序列的获得和免疫基因的富集,丰富了中华绒螯蟹的基因组信息,初步了解了中华绒螯蟹固有免疫系统的概况,为进一步克隆和研究中华绒螯蟹免疫防御功能基因提供了序列基础。本研究在EST分析的基础上,克隆获得了中华绒螯蟹酚氧化酶系统10个基因的cDNA全长序列,它们分别是前酚氧化酶(EsproPO),丝氨酸蛋白酶同源物(EsSPH),丝氨酸蛋白酶抑制剂pacifastin, serpin, PAPII (EsPLC, Es serpin, EsPAPII),模式识别丝氨酸蛋白酶(EsPRSP),peroxinectin (Esperoxinectin)和3个前酚氧化酶激活酶(EsPAP1, 2, 3)。它们与相近物种的酚氧化酶系统相应基因均具有较高同源性,并含有胰酶催化结构域,CLIP结构域,PLD结构域,KAZAL结构域,Serpin结构域以及酚氧化酶结构域等酚氧化酶系统相应基因典型的特征结构域。分析发现,PAPs的CLIP结构域和PRSP,Pacifastin,Proxinectin,proPO基因是节肢动物特有的,是酚氧化酶系统作为节肢动物特有免疫机制的分子基础。本研究从多个基因的3′UTR区发现了调控元件,如15-LOX-DICE,K-box和Brd-Box。在所推断的蛋白中,EsPAP3和EsPAPII的等电点呈碱性,Esperoxinetin的为中性,而EsPRSP,EsSPH,EsproPO, EsPAPII, Esserpin,EsPAP1的等电点在酸性区间。健康中华绒螯蟹EsPAP1,EsPAP2,EsPAPII基因在肌肉中的表达量最高,而在血细胞中的表达量相对较低;EsPAP3,EsproPO,EsPLC基因在血细胞中表达量较高,在肌肉中的表达量最低。其中,EsPAP3在血细胞中的表达量是其在肌肉组织中表达量的526.35倍。调控元件和多种激活酶与抑制剂的存在、组织分布和等电点的差异,说明中华绒螯蟹酚氧化酶系统在转录、翻译、激活等多个层次上受到了调控。在中华绒螯蟹受到鳗弧菌刺激后,EsPAP1,EsPAP2,EsPAP3,EsPLC和EsPAPII基因的表达量呈上升或下降的趋势,但表达量的极限值均出现在2小时和12小时,这一规律与EsproPO应激后的mRNA表达和酶比活力的变化特点相吻合,说明中华绒螯蟹酚氧化酶系统各因子相互协调共同参与中华绒螯蟹对入侵细菌的防御反应。同时EsPAP2,EsPAP3,EsproPO,EsPAPII,EsPLC在中华绒螯蟹受到鳗弧菌刺激后的表达呈现反复多次上升,表明酚氧化酶系统可能参与了多种免疫反应。研究还发现EsPAP1参与中华绒螯蟹血液凝集过程,而EsPAP3是蟹血细胞中的有效的前酚氧化酶激活因子。研究结果初步揭示了中华绒螯蟹酚氧化酶系统的分子基础、对微生物的响应机制及其调控机制和演化趋势,为节肢动物固有免疫系统研究奠定了良好基础。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
第一章 引言  13-42
  1 中华绒螯蟹的科研和经济价值  13-15
  2 无脊椎动物固有免疫系统  15-25
    2.1 非己的识别  16-17
      2.1.1 病原相关分子模式  16
      2.1.2 模式识别受体  16-17
    2.2 免疫信号的调整放大和信号传导  17-18
      2.2.1 Toll 信号通路  17-18
      2.2.2 Imd 信号通路  18
    2.3 免疫效应  18-25
      2.3.1 细胞免疫效应  19-20
      2.3.2 体液免疫效应  20-25
  3 重要的固有免疫机制——酚氧化酶免疫系统  25-40
    3.1 酚氧化酶系统简介  25-27
      3.1.1 酚氧化酶系统的发现  25-26
      3.1.2 酚氧化酶系统的进化  26-27
      3.1.3 酚氧化酶系统参与的生物学过程  27
    3.2 酚氧化酶系统的组成及其分子功能  27-35
      3.2.1 识别相关因子  28-29
      3.2.2 丝氨酸蛋白酶  29-30
      3.2.3 丝氨酸蛋白酶同源物  30
      3.2.4 丝氨酸蛋白酶抑制剂  30-32
      3.2.5 酚氧化酶  32-34
      3.2.6 其它因子  34-35
    3.3 酚氧化酶系统的调控  35-40
      3.3.1 基因水平的调控  35-36
      3.3.2 转录水平的调控  36
      3.3.3 翻译水平的调控  36
      3.3.4 翻译后的调控  36
      3.3.5 酚氧化酶酶原的激活  36-39
      3.3.6 酚氧化酶活性的抑制  39
      3.3.7 对调控因子的调控  39
      3.3.8 其它层次的调控  39-40
    3.4 酚氧化酶系统研究展望  40
  4 本研究的目的与意义  40-42
第二章 材料与方法  42-63
  1 实验材料  42-45
    1.1 构建cDNA 文库的螃蟹样品及其处理  42
    1.2 菌刺激和损伤刺激用样品及其处理  42
    1.3 主要化学试剂及仪器设备  42-45
      1.3.1 主要化学试剂  42-43
      1.3.2 培养基和试剂的配置  43-44
      1.3.3 主要仪器设备  44-45
  2 实验方法  45-63
    2.1 中华绒螯蟹总RNA 的提取及cDNA 模版的制备  45-47
      2.1.1 实验用品的预处理  45
      2.1.2 RNA 提取过程  45-46
      2.1.3 cDNA 模板的反转录  46-47
    2.2 cDNA 文库的构建与质量评估  47
      2.2.1 cDNA 文库构建  47
      2.2.2 质量指标  47
    2.3 EST 分析  47
    2.4 全长基因的克隆  47-52
      2.4.1 cDNA 文库克隆的保存和测序  47-48
      2.4.2 RACE 扩增  48-49
      2.4.3 琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物  49-50
      2.4.4 感受态细胞的制备、连接和转化  50-52
    2.5 基因组织分布情况和时序表达的定量检测  52-54
      2.5.1 荧光实时定量PCR 的原理  52-53
      2.5.2 引物设计和扩增条件的确立  53
      2.5.3 目的基因表达量的检测  53-54
    2.6 中华绒螯蟹各组织酚氧化酶活力的测定  54-56
      2.6.1 中华绒螯蟹各组织粗酶液的制备  54
      2.6.2 总蛋白浓度的测定（考马斯亮蓝法）  54-56
      2.6.3 酚氧化酶比活力的测定  56
    2.7 蛋白的原核重组表达  56-59
      2.7.1 重组质粒构建  56-57
      2.7.2 重组蛋白的表达与检测  57
      2.7.3 重组蛋白的纯化  57-58
      2.7.4 重组蛋白的复性  58-59
      2.7.5 重组蛋白的浓度测定  59
    2.8 RNAi  59-63
      2.8.1 引物设计  59-60
      2.8.2 dsRNA 的合成  60-62
      2.8.3 干扰实验及其效果检验  62-63
第三章 实验结果  63-151
  1 中华绒螯蟹 cDNA 文库  63
  2 EST（表达序列标签）分析  63-68
    2.1 EST 信息  63-65
    2.2 Blast 比对分析  65-66
    2.3 EST 的分类和功能注释  66-68
  3 免疫相关基因的鉴定  68
  4 中华绒螯蟹酚氧化酶系统基因的研究  68-147
    4.1 中华绒螯蟹模式识别丝氨酸蛋白酶（EsPRSP）的cDNA 特征及mRNA 表达  75-82
      4.1.1 EsPRSP 全长cDNA 的获得  75-76
      4.1.2 EsPRSP 一级结构、同源性分析和空间结构预测  76-82
    4.2 中华绒螯蟹前酚氧化酶激活酶1（EsPAP1）的克隆、表达及RNAi 效应  82-92
      4.2.1 EsPAP1 全长cDNA 的获得  82
      4.2.2 EsPAP1 结构、同源性和进化分析  82-88
      4.2.3 EsPAP1 的组织分布  88
      4.2.4 EsPAP1 基因的时序表达  88-90
      4.2.5 注射EsPAP1 dsRNA 后中华绒螯蟹体色和酶活力的变化  90-92
    4.3 中华绒螯蟹前酚氧化酶激活酶2（EsPAP2）的克隆、表达  92-100
      4.3.1 EsPAP2 全长cDNA 的获得  92
      4.3.2 EsPAP2 结构、同源性和进化分析  92-99
      4.3.3 EsPAP2 的组织分布  99
      4.3.4 EsPAP2 基因的时序表达  99-100
    4.4 中华绒螯蟹前酚氧化酶激活酶3（EsPAP3）的克隆、表达及RNAi 效应  100-108
      4.4.1 EsPAP3 全长cDNA 的获得  100-104
      4.4.2 EsPAP3 的组织分布  104-105
      4.4.3 EsPAP3 的时序表达  105-106
      4.4.4 注射EsPAP3 dsRNA 后酚氧化酶活性的变化  106-107
      4.4.5 EsPAP3 成熟肽的原核重组表达  107-108
    4.5 中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶同源物（EsSPH）的克隆、表达  108-113
      4.5.1 EsSPH 全长cDNA 的获得  108-109
      4.5.2 EsSPH 结构、同源性和进化分析  109-113
    4.6 中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶及其同源物的比较分析  113-122
      4.6.1 EsPRSP, EsPAPs, EsSPH 之间的相似性比较  113-115
      4.6.2 EsPAPs 和EsSPH 与其它物种同源序列的多序列比对和进化分析  115-122
    4.7 中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin（Esserpin）的克隆与表达  122-125
      4.7.1 Esserpin 全长cDNA 的获得  122
      4.7.2 Esserpin 的结构特征和同源性分析  122-125
    4.8 中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶抑制剂PAP II（EsPAP II）的克隆与表达  125-129
      4.8.1 EsPAP II cDNA 全长序列的获得  125
      4.8.2 EsPAP II 的结构、同源性和进化分析  125-128
      4.8.3 EsPAP II 的组织分布  128-129
      4.8.4 EsPAP II 基因的时序表达  129
    4.9 中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶抑制剂pacifastin（EsPLC）的克隆与表达  129-134
      4.9.1 EsPLC 的结构、同源性和进化分析  129-132
      4.9.2 EsPLC 的组织分布  132-133
      4.9.3 EsPLC 基因的时序表达  133-134
    4.10 中华绒螯蟹前酚氧化酶基因（EsproPO）的克隆、表达和酶活力  134-142
      4.10.1 中华绒螯蟹前酚氧化酶基因（EsproPO）cDNA 全长序列的获得  134
      4.10.2 EsproPO 结构、同源性和进化分析  134-140
      4.10.3 EsproPO mRNA 和酶活力的组织分布  140
      4.10.4 EsproPO mRNA 和酶活力的时序变化  140-142
    4.11 中华绒螯蟹酚氧化酶调控因子Peroxinetin（Esperoxinectin）的克隆与表达.  142-147
      4.11.1 EsPeroxinetin cDNA 全长序列的获得  142
      4.11.2 Esperoxinectin 结构、同源性和进化分析  142-147
  5 中华绒螯蟹酚氧化酶系统各因子的进化分析  147-151
第四章 讨论  151-171
  1 中华绒螯蟹表达序列和免疫基因的富集  151-153
  2 中华绒螯免疫相关基因的鉴定  153-156
    2.1 凝血与黑化相关因子  153-154
    2.2 Toll 信号通路相关因子  154-155
    2.3 补体系统  155
    2.4 压力相关免疫因子  155-156
    2.5 凋亡相关和其它免疫因子  156
  3. 中华绒螯蟹酚氧化酶系统相关分子  156-168
    3.1 中华绒螯蟹模式识别丝氨酸蛋白酶（EsPRSP）  156-158
    3.2 中华绒螯蟹前酚氧化酶激活酶1（EsPAP1）  158-160
    3.3 中华绒螯蟹酚氧化酶激活酶2（EsPAP2）  160-161
    3.4 中华绒螯蟹酚氧化酶激活酶3（EsPAP3）  161-162
    3.5 中华绒螯蟹Pacifastin 抑制剂(EsPLC)  162-164
    3.6 中华绒螯蟹KAZAL 型丝氨酸蛋白酶抑制剂PAPII  164-165
    3.7 中华绒螯蟹酚氧化酶（EsproPO）  165-167
    3.8 中华绒螯蟹EsSPH，Esserpin，Esperoxinectin 基因  167-168
  4. 中华绒螯蟹酚氧化酶系统的调控  168-169
  5. 中华绒螯蟹酚氧化酶系统的进化  169-171
结论  171-173
参考文献  173-195
撰写和发表论文情况  195-196
致谢  196

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