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菌丝霉素的异源表达、抑菌机理及其构效关系研究

作　者: 杨雅麟
导　师: 王建华
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 菌丝霉素 表达 性质功能 构效关系 抑菌机理
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


菌丝霉素(Plectasin)是从腐生子囊菌(the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella)中分离得到首例真菌防御素,Plectasin具有有效的抗革兰氏阳性菌且无溶血性等功能,是一种具有治疗潜能的肽抗生素。本文重点研究了Plectasin的大肠杆菌高效融合表达、性质功能、二硫键构效关系及其抑菌机理。取得主要结果如下:1)通过整合三个影响表达的关键策略:抗菌肽基因的宿主密码子优化、硫氧还蛋白融合表达和柱上切割,成功实现了一个富含二硫键Plectasin基因在大肠杆菌中的高效表达。融合蛋白Trx-Plectasin的表达水平为细胞总蛋白的53.6%,约58.5%的融合蛋白以可溶形式表达。经亲和层析纯化到均一的融合蛋白。采用Xa因子柱上酶切融合蛋白有效获得重组的Plectasin,质谱分析重组Plectasin的分子量与其理论分子量相符。经凝胶过滤层析和反相高效液相色谱有效获得高纯度的plectasin。2)从折叠、氧化还原、热处理、离子影响、最小抑菌试验和溶血性试验等方面研究了Plectasin的性质及功能。Plectasin在含有鏊合剂EDTA和甘油的TGE缓冲液中折叠效率远高于在HAc缓冲液中折叠效率,在HAc缓冲液中添加Arg对Plectasin的折叠有一个重要的正效应。氧化还原和热处理结果表明破坏Plectasin二硫键影响其稳定性进而影响其抗菌活性。离子影响实验结果表明一价阳离子对Plectasin的抗菌活性没有影响,二价阳离子能强烈影响Plectasin的抗菌活性,其中钙离子的影响明显比镁离子强;最小抑菌实验结果表明重组的plectasin可以有效抑制革兰氏阳性菌,但对革兰氏阴性菌和丝状真菌基本没有抗菌活性。溶血实验结果表明Plectasin对兔的红细胞无溶血性。3)采用丙氨酸突变成对半胱氨酸的方法设计Plectasin二硫键突变体,结合生物信息学工具对其一级和二级结构参数进行预测,同时采用毕赤酵母X-33分泌重组表达Plectasin及其二硫键突变体,研究不同二硫键对Plectasin抗菌活性的影响,结果表明不同二硫键对Plectasin的抗菌活性影响程度不同, C1-C4二硫键对其抗菌活性影响最大,C3-C6二硫键影响次之,C2-C5影响最小。4)通过离子影响试验、形态学观察以及凝胶阻滞试验,初步推论Plectasin对金黄色葡萄球菌的抑菌机理为:Plectasin不具有与细胞内物质DNA结合的能力,其与细胞表面的作用方式并非简单的静电相互吸引作用,而主要通过特异性与细胞壁上的二价阳离子结合位点如磷壁酸(TA)和脂磷壁酸发生反应,竞争性取代在细胞壁起桥梁和电荷中和作用的二价阳离子,如Ca2+和Mg2+离子,1)可能导致细胞壁紊乱,增加了细胞壁的渗透性,形成孔洞,内容物渗漏,最后导致整个细胞的裂解死亡;2)也可能是通过取代和激活自溶素,导致溶菌酶的失控降解,使细胞自发裂解死亡。总之,本研究成功实现了一个富含二硫键Plectasin基因在大肠杆菌中的高效表达,为生产富含二硫键的防御素提供了一个有效的平台;证实了Plectasin二硫键影响其稳定性进而影响其抗菌活性,且不同二硫键对Plectasin的抗菌活性影响的程度不同;提出了Plectasin特异性结合细胞壁上的二价阳离子结合位点如磷壁酸(TA)和脂磷壁酸的抑菌机理,为阐明Plectasin的作用机制奠定基础。这些结果对于抗革兰氏阳性菌病特别是链球菌病的预防药物新产品的开发提供理论依据,促进Plectasin在防控链球菌病上的应用。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-16
第一章 绪论  16-28
  1.1 防御素的研究进展  17-23
    1.1.1 防御素的种类及其分子结构特征  17-19
    1.1.2 防御素的生物学功能  19-21
    1.1.3 防御素的抗菌机理  21-23
  1.2 真菌防御素Plectasin 的研究进展  23-25
    1.2.1 Plectasin 的结构  23-24
    1.2.2 Plectasin 的生物学功能  24-25
    1.2.3 Plectasin 的基因工程表达  25
  1.3 相关研究方法综述  25-27
    1.3.1 防御素构效关系研究方法  25-26
    1.3.2 抑菌机理研究方法  26
    1.3.3 防御素的基因工程表达  26-27
  1.4 本研究思路、目的和意义  27-28
    1.4.1 本研究思路  27
    1.4.2 本研究目的和意义  27-28
第二章 Plectasin 在大肠杆菌中融合表达与纯化  28-48
  2.1 引言  28-29
  2.2 实验材料  29-31
    2.2.1 质粒与菌株  29
    2.2.2 DNA 修饰酶类与其他生化试剂  29
    2.2.3 基因合成及DNA 测序  29
    2.2.4 培养基及缓冲液等试剂配制  29-30
    2.2.5 主要仪器设备  30-31
  2.3 实验方法  31-35
    2.3.1 Plectasin 基因序列设计、合成及重组表达载体构建  31
    2.3.2 重组表达菌株E. coli BL21（DE3）pET32a/Plectasin 的构建  31-32
    2.3.3 融合蛋白诱导表达  32-33
    2.3.4 融合蛋白纯化  33
    2.3.5 Xa 因子裂解融合蛋白  33
    2.3.6 柱上切割融合蛋白  33
    2.3.7 SDS-PAGE 电泳和Tricine-SDS-PAGE 电泳  33-34
    2.3.8 琼脂扩散抑菌试验  34
    2.3.9 重组Plectasin 的凝胶过滤层析分离  34-35
    2.3.10 重组Plectasin 的反相高效液相色谱RP-HPLC 进一步分离  35
  2.4 结果  35-46
    2.4.1 Plectasin 密码子的优化设计  35-36
    2.4.2 重组表达载体构建及转化筛选  36
    2.4.3 融合蛋白基因表达条件的优化  36-38
    2.4.4 融合蛋白的纯化  38-39
    2.4.5 Xa 因子液相酶切切割融合蛋白及切割产物的活性检测  39-40
    2.4.6 Xa 因子固相柱上切割融合蛋白  40-42
    2.4.7 Superdex peptide 10/30 凝胶过滤层析分离  42-44
    2.4.8 反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化  44-46
  2.5 讨论与结论  46-48
    2.5.1 讨论  46
    2.5.2 结论  46-48
第三章 重组 Plectasin 的性质与功能研究  48-60
  3.1 引言  48
  3.2 实验材料  48-49
  3.3 实验方法  49-51
    3.3.1 Plectasin 的折叠  49
    3.3.2 Plectasin 的氧化、还原和热处理  49-50
    3.3.3 抑菌实验  50
    3.3.4 阳离子对Plectasin 抗菌活性的影响  50-51
    3.3.5 溶血实验  51
  3.4 结果  51-58
    3.4.1 Plectasin 的折叠  51-53
    3.4.2 Plectasin 二硫键的功能  53-55
    3.4.3 Plectasin 的抗菌活性  55-56
    3.4.4 离子对Plectasin 的抗菌活性的影响  56-57
    3.4.5 Plectasin 的溶血性  57-58
  3.5 讨论与结论  58-60
    3.5.1 讨论  58-59
    3.5.2 结论  59-60
第四章 Plectasin 二硫键的构效关系探索  60-68
  4.1 引言  60
  4.2 生物信息学工具及实验材料  60-61
    4.2.1 生物信息学工具  60-61
    4.2.2 实验材料  61
  4.3 实验方法  61-63
    4.3.1 Plectasin 及其二硫键突变体的物理化学特性分析及结构预测  61
    4.3.2 Plectasin 及其二硫键突变体基因设计合成、重组表达载体构建及鉴定  61-62
    4.3.3 Plectasin 及其二硫键突变体表达载体的电转化与筛选  62-63
    4.3.4 重组酵母的诱导表达  63
    4.3.5 抑菌试验  63
  4.4 结果  63-67
    4.4.1 Plectasin 及其二硫键突变体的理化特性参数计算  63-64
    4.4.2 Plectasin 及其二硫键突变体的二级结构特征预测  64-65
    4.4.3 琼脂扩散法监测Plectasin 及其二硫键突变体诱导表达产物抑菌活性  65-67
  4.5 讨论与结论  67-68
    4.5.1 讨论  67
    4.5.2 结论  67-68
第五章 Plectasin 的抑菌机理初步研究  68-73
  5.1 引言  68
  5.2 实验材料  68
  5.3 实验方法  68-69
    5.3.1 扫描电镜成像  68-69
    5.3.2 凝胶阻滞实验  69
  5.4 结果  69-71
    5.4.1 Plectasin 对金黄色葡萄球菌细胞形态学的影响  69-70
    5.4.2 Plectasin 与DNA 相互作用  70-71
  5.5 讨论与结论  71-73
    5.5.1 讨论  71-72
    5.5.2 结论  72-73
第六章 结论  73-76
参考文献  76-86
致谢  86-87
作者简历  87-88

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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