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从鱼到人：主要病原性弧菌的致病机理研究

作　者: 芮浩鹏
导　师: 张元兴；Matthew K.Waldor
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 溶藻弧菌霍乱弧菌副溶血弧菌群体感应 LuxRval Asp 减毒活疫苗鞭毛蛋白 T3SS
分类号: S941
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在海洋环境中,大多数的弧菌是最常见的细菌类群,它们维持着正常的海洋生态环境,但是某些弧菌却对人类和海水动物有害。本课题分别对海水养殖鱼类的致病细菌溶藻弧菌进行了群体感应系统以及调控的致病因子研究,在新生幼兔模型上对人源性病原菌霍乱弧菌进行了减毒活疫苗副作用机制的研究以及在新生幼兔模型上对重要食源性致病菌副溶血弧菌进行了致病机理研究。溶藻弧菌是我国南方海水养殖中重要的病原菌,但是其主要的致病因子和致病机理仍然未知。本课题发现了溶藻弧菌具有与哈维氏弧菌相似的群体感应系统,并对其中枢调控因子LuxRval进行了功能研究。luxRval基因的表达呈细胞密度依赖型,在低密度时luxRval基因的表达量很低,在高密度时luxRval基因大量表达。溶藻弧菌LuxRval蛋白调控多种生理功能,对胞外多糖和胞外蛋白酶的合成具有正调控作用,对运动性则具有负调控作用。我们发现LuxRval蛋白对溶藻弧菌分泌的碱性丝氨酸蛋白酶Asp具有调控作用。碱性丝氨酸蛋白酶Asp在生长对数末期(细菌高密度)表达,luxRval基因的缺失会导致Asp的表达量大大降低。通过对碱性丝氨酸蛋白酶Asp的基因功能研究,证明Asp是溶藻弧菌分泌的最主要胞外蛋白酶,是溶藻弧菌感染斑马鱼的一个重要毒力因子。asp基因缺失导致溶藻弧菌感染斑马鱼的半致死剂量提高15倍,并且对鲤鱼上皮瘤细胞的细胞毒性作用减弱。霍乱是由霍乱弧菌引起的一种古老的传染病,疫苗是防治霍乱的一种有效的方式。霍乱减毒活疫苗具有较好的免疫效果,但是通常也伴随有比较大的副作用。本课题应用新生幼兔动物模型对霍乱减毒活疫苗副作用机制进行研究。我们发现,霍乱毒素缺失菌株Peru-NT能够感染幼兔,并在小肠内克隆繁殖,幼兔通常会有轻度至中度的腹泻现象。霍乱弧菌鞭毛是造成疫苗副作用最主要的原因,因为幼兔在受霍乱弧菌鞭毛蛋白缺失株ΔflaABCDE感染后,90%的幼兔不再出现腹泻现象。我们证明了霍乱弧菌鞭毛蛋白是疫苗副作用的产生原因,而非游动性和鞭毛结构。霍乱弧菌的所有5个鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD和FlaE都对疫苗副作用具有贡献,在敲除其中一个或者几个鞭毛蛋白后,仍能导致幼兔产生腹泻。幼兔腹泻现象与野生型和鞭毛突变株在肠道内的克隆繁殖和定位差异无关。与野生型相比,幼兔在受鞭毛蛋白缺失株ΔflaABCDE感染后,先天免疫反应降低,许多促炎症细胞因子的mRNA表达量降低。因此,我们认为鞭毛蛋白导致腹泻现象主要与其介导的先天免疫反应相关,过强或者异常的肠道免疫反应,可能导致宿主出现腹泻现象。这些试验结果为霍乱减毒活疫苗的开发提供了新的策略。副溶血弧菌是一种重要的食源性致病菌。目前对副溶血弧菌致病机理不清楚,主要原因是没有合适的动物模型可以用来研究其致病机理。我们开发了动物模型(新生幼兔)来研究副溶血弧菌致病机理。口服含有副溶血弧菌的溶液后,87%的新生幼兔受感染,出现腹泻现象。一般来说,幼兔在被感染30 h左右出现腹泻现象,但是,不同幼兔出现腹泻现象的时间会有差异。在解剖新生幼兔时也发现其肠道内有很多液体积累。我们发现,位于小染色体上的第二套三型分泌系统(T3SS2)是副溶血弧菌的主要致病因子,缺失T3SS2后的副溶血弧菌基本丧失了在幼兔肠道内的克隆繁殖能力,幼兔不会出现腹泻现象,肠道内也没有液体的积累。而溶血素TDH和大染色体上的第一套三型分泌系统(T3SS1)与副溶血弧菌对幼兔的致病无关。用荧光定量PCR检测幼兔肠道内不同促炎症细胞因子(IL-6,IL-8,TNF-α,IL-1β)的表达水平时,发现野生型、T3SS1和tdh突变株感染的幼兔体内的促炎症细胞因子的表达水平比被T3SS2突变株感染时高很多倍。组织病理学研究表明,野生型、tdh和T3SS1突变株的感染导致幼兔小肠中端至末端出现细胞增殖、细胞脱落、组织充血、中性粒细胞聚集、水肿、肠道绒毛缩短等严重病理现象,而T3SS2突变株不会对幼兔小肠造成明显的病理现象,基本与缓冲液处理的幼兔一样。最后,荧光共聚焦显微镜实验观察到副溶血弧菌会在肠道形成微菌落,通常零散地分布于肠道绒毛壁和肠道空腔。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第1章文献综述  13-40
  1.1 弧菌和弧菌病  13-14
    1.1.1 海水养殖鱼类的致病弧菌  13
    1.1.2 感染人类的病原性弧菌  13-14
  1.2 重要的海水养殖致病菌——溶藻弧菌  14-20
    1.2.1 溶藻弧菌的致病机理和主要毒力因子  14-17
      1.2.1.1 胞外蛋白酶  15-16
      1.2.1.2 铁载体  16
      1.2.1.3 胞外多糖和生物被膜  16
      1.2.1.4 三型分泌系统  16-17
    1.2.2 群体感应系统  17-20
      1.2.2.1 费氏弧菌中的LuxR/LuxI系统  17-18
      1.2.2.2 哈维氏弧菌中的杂合型系统  18-19
      1.2.2.3 群体感应系统LuxR转录调控因子  19-20
  1.3 重要传染病霍乱致病菌——霍乱弧菌  20-31
    1.3.1 霍乱疫情  21
    1.3.2 霍乱弧菌的致病机理与毒力因子  21-22
    1.3.3 研究霍乱弧菌致病机理的动物模型  22-25
    1.3.4 霍乱疫苗  25-28
      1.3.4.1 注射型疫苗  25
      1.3.4.2 口服型灭活疫苗  25-26
      1.3.4.3 口服型减毒活疫苗  26-27
      1.3.4.4 单位疫苗  27-28
    1.3.5 霍乱弧菌鞭毛和运动性  28-31
      1.3.5.1 霍乱弧菌鞭毛功能和结构  28
      1.3.5.2 鞭毛与免疫系统  28-31
  1.4 食物中毒重要致病菌——副溶血弧菌  31-37
    1.4.1 副溶血弧菌引发的食物中毒事件  31-32
    1.4.2 副溶血弧菌的主要致病因子  32-37
      1.4.2.1 耐热直接溶血素(TDH)  32-34
      1.4.2.2 TDH相关溶血毒素(TRH)  34
      1.4.2.3 尿素酶  34
      1.4.2.4 三型分泌系统  34-37
    1.4.3 研究副溶血弧菌致病机理的动物模型  37
  1.5 本课题的主要内容和意义  37-40
第2章溶藻弧菌luxR基因的克隆、突变株构建及功能鉴定  40-60
  2.1 前言  40
  2.2 实验材料  40-41
    2.2.1 菌种、质粒、引物和培养基  40
    2.2.2 主要试剂、试剂盒和仪器设备  40-41
  2.3 实验方法  41-49
    2.3.1 溶藻弧菌luxR_(val)基因克隆及测序  41-43
    2.3.2 溶藻弧菌luxR_(val)基因无标记缺失突变株的构建  43-45
      2.3.2.1 克隆luxR_(val)内部基因  44
      2.3.2.2 pDM-luxR质粒的构建  44-45
      2.3.2.3 筛选目的突变株  45
    2.3.3 溶藻弧菌互补菌株luxR_(val)~+的构建  45-46
    2.3.4 溶藻弧菌生长特性的考察  46
    2.3.5 胞外蛋白酶活性测定  46
    2.3.6 游动性和群游性测定  46
    2.3.7 胞外多糖的测定  46-48
    2.3.8 实时荧光定量PCR  48-49
  2.4 实验结果  49-58
    2.4.1 溶藻弧菌luxR_(val)基因的克隆及测序及序列分析  50
    2.4.2 筛选和鉴定luxR_(val)基因无标记缺失突变株  50-52
    2.4.3 溶藻弧菌△luxR_(val)互补株构建结果  52
    2.4.4 溶藻弧菌野生株和突变株△luxR_(val)的生长情况  52-53
    2.4.5 luxR_(val)基因在生长周期中的表达情况  53-55
    2.4.6 溶藻弧菌luxR_(val)突变对胞外蛋白酶活性的影响  55-56
    2.4.7 溶藻弧菌luxR_(val)突变对运动性的影响  56-58
    2.4.8 溶藻弧菌luxR_(val)突变对胞外多糖合成的影响  58
  2.5 小结  58-60
第3章溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶Asp毒力作用及调控  60-73
  3.1 前言  60
  3.2 实验材料  60-62
    3.2.1 菌株、质粒、引物和培养基  60-62
    3.2.2 主要试剂、生物软件和及仪器设备  62
  3.3 实验方法  62-65
    3.3.1 碱性丝氨酸蛋白酶基因asp的克隆与测序  62
    3.3.2 蛋白酶基因asp插入失活突变株的构建  62-63
    3.3.3 胞外蛋白酶活性测定  63
    3.3.4 斑马鱼感染实验  63-64
    3.3.5 细胞毒性检测  64-65
    3.3.6 实时荧光定量PCR  65
  3.4 实验结果  65-71
    3.4.1 溶藻弧菌asp基因的克隆、测序及序列分析  65
    3.4.2 插入突变株asp~-的构建  65
    3.4.3 Asp对胞外蛋白酶活性的影响  65-67
    3.4.4 Asp对斑马鱼毒力的作用  67-68
    3.4.5 Asp对EPC细胞的毒性作用  68
    3.4.6 溶藻弧菌asp基因在整个生长周期中的表达情况  68-69
    3.4.7 群体感应系统对asp的调控  69-71
  3.5 讨论  71-72
  3.6 小结  72-73
第4章霍乱弧菌减毒活疫苗副作用的研究  73-95
  4.1 前言  73-74
  4.2 实验材料  74-76
    4.2.1 菌株、质粒、引物和培养基  74-76
    4.2.2 主要试剂、仪器设备和分析处理软件  76
  4.3 实验方法  76-83
    4.3.1 绿色荧光蛋白GFP标记的霍乱弧菌构建  76-79
    4.3.2 霍乱弧菌突变株和互补菌株flaA~+的构建  79-80
    4.3.3 生长曲线测定  80
    4.3.4 霍乱弧菌游动性测定  80
    4.3.5 免疫印迹试验  80-81
    4.3.6 透射电子显微镜观察霍乱弧菌鞭毛  81
    4.3.7 霍乱弧菌感染新生幼兔试验  81-82
    4.3.8 新生幼兔肠道内的霍乱弧菌计数  82
    4.3.9 组织病理切片制备、苏木精及伊红染色及切片显微镜观察  82
    4.3.10 冷冻切片制备,免疫染色及激光切片共聚焦显微镜观察  82-83
    4.3.11 RNA提取以及实时荧光定量PCR试验  83
  4.4 实验结果  83-93
    4.4.1 新生幼兔模型的应用  83-86
    4.4.2 霍乱弧菌Peru-NT鞭毛突变株的构建及表型检测  86-87
    4.4.3 Peru-NT鞭毛蛋白突变株疫苗不具有副作用——新生幼兔腹泻现象消失  87-89
    4.4.4 腹泻现象并非由霍乱菌株在肠道内克隆繁殖能力差异和定位差异造成  89-90
    4.4.5 Peru-NT鞭毛蛋白突变株降低了宿主对霍乱弧菌的免疫反应  90-93
  4.5 讨论  93-94
  4.6 小结  94-95
第5章副溶血弧菌的致病机理  95-117
  5.1 前言  95-96
  5.2 实验材料  96-99
    5.2.1 菌株、质粒、引物和培养基  96-97
    5.2.2 主要试剂、仪器设备和分析处理软件  97-99
  5.3 实验方法  99-103
    5.3.1 生长曲线测定  99
    5.3.2 绿色荧光蛋白GFP标记的副溶血弧菌构建  99-100
    5.3.3 副溶血弧菌感染新生幼兔试验  100-101
    5.3.4 感染后的新生幼兔肠道内液体的收集  101
    5.3.5 感染后的新生幼兔肠道内副溶血弧菌菌落计数  101
    5.3.6 组织病理切片制备,苏木精及伊红染色及切片显微镜观察  101-102
    5.3.7 冷冻切片制备,免疫染色及切片激光共聚焦显微镜观察  102
    5.3.8 RNA提取以及实时荧光定量PCR实验  102-103
  5.4 实验结果  103-113
    5.4.1 新生幼兔动物模型的应用  103
    5.4.2 副溶血弧菌感染幼兔导致腹泻因幼兔个体不同而有差异  103-104
    5.4.3 第二套三型分泌系统(T3SS2)是副溶血弧菌的主要毒力因子  104-106
    5.4.4 副溶血弧菌野生型及其突变株在肠道内的克隆繁殖和定位  106-112
    5.4.5 副溶血弧菌的感染增强了宿主的免疫反应  112-113
    5.4.6 副溶血弧菌感染后的幼兔肠道组织切片  113
  5.5 讨论  113-116
  5.6 小结  116-117
第6章结论和展望  117-121
  6.1 主要结论  117-118
  6.2 创新点  118-119
  6.3 展望  119-121
参考文献  121-132
攻读博士学位期间撰写的论文  132-133
致谢  133

从鱼到人：主要病原性弧菌的致病机理研究

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