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Ghrelin对大鼠下丘脑—垂体—性腺的影响及其机理研究

作　者: 王琳
导　师: 章孝荣
学　校: 安徽农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: Ghrelin 侧脑室注射 SD大鼠
分类号: S865.12
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:探讨Ghrelin、GHS-R1a在下丘脑-垂体-性腺上的定位以及Ghrelin mRNA在其上的表达。分析Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA在不同发情周期大鼠下丘脑-垂体-卵巢上的表达丰度。研究外源性Ghrelin对促性腺激素、性腺激素的分泌及其基因表达的影响。从而揭示Ghrelin对大鼠生殖轴的作用途径和机理。方法:(1)分离成年SD大鼠的下丘脑、垂体、卵巢和睾丸,经4%多聚甲醛固定,制成石蜡切片,采用免疫组织化学方法观察Ghrelin及其受体GHS-R1a在上述组织中的定位。(2)使用地高辛标记的Ghrelin寡核苷酸探针,采用原位杂交方法观察Ghrelin mRNA在下丘脑、垂体、卵巢和睾丸中的表达。(3)实时荧光定量PCR法分析Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA在不同发情周期大鼠下丘脑、垂体、卵巢上的表达丰度。(4)采用1%的戊巴比妥钠1mL对大鼠进行腹腔注射,麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪,采用不同剂量的Ghrelin(0.3nmol、1nmol、3nmol和生理盐水对照组)对雄性大鼠和不同发情周期大鼠进行侧脑室注射,15 min后断头采血,酶联免疫分析法测血清促黄体素、促卵泡素浓度,放射免疫分析法测血清睾酮、雌激素和孕酮的浓度。(5)分离试验四大鼠的下丘脑、垂体、卵巢和睾丸,实时荧光定量PCR法分析FSH、LH、GnRH、AR、ERβ和PRA+B mRNA表达丰度。(6)成年雄性大鼠和25 d的雌性大鼠断头处死,收集睾丸间质细胞、黄体细胞和颗粒细胞于CO2培养箱内培养6 h,收集培养液和细胞,采用酶联免疫、放射免疫分析法测培养液中睾酮、雌激素和孕酮的浓度,实时荧光定量PCR法分析AR、ERβ和PRA+BmRNA的表达丰度。结果:(1)Ghrelin与其受体GHS-R1a在下丘脑弓状核、腹内侧核、正中隆起,腺垂体,睾丸间质细胞、精母细胞、睾丸支持细胞,卵母细胞等中均有分布。(2)在下丘脑、垂体、睾丸中,Ghrelin mRNA显示和Ghrelin一致的分布方式,在卵巢中,显示出差异性表达。(3)Ghrelin和GHS-R1a在不同发情周期大鼠的下丘脑、垂体中均有表达,且其表达丰度随发情周期的变化而变化。在卵巢中仅发现Ghrelin mRNA表达,在整个发情周期均未检测到GHS-R1a mRNA表达。(4)侧脑室注射Ghrelin能抑制促性腺激素、性腺激素的分泌,其作用效果与所处发情周期、注射的剂量、性别有关。(5)侧脑室注射Ghrelin显著抑制GnRH mRNA、FSH mRNA、LH mRNA、ERβmRNA、PRA+B mRNA、AR mRNA的表达,其抑制效果与注射剂量与所处发情周期有关。(6)在体外,Ghrelin显著抑制孕酮、雌激素的分泌和ERβmRNA、PRA+B mRNA的表达。但对睾酮的分泌、AR mRNA的表达不起作用。结论:Ghrelin、GHS-R1a和Ghrelin mRNA在大鼠下丘脑、垂体和性腺上均有分布,Ghrelin通过与其受体相互作用,在中枢和外周水平上抑制大鼠促性腺激素和性腺激素的分泌和促性腺激素释放激素、促性腺激素和性腺激素受体基因的表达,且这种抑制作用受发情周期、剂量、性别的限制。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-16
缩略词  16-18
文献综述 Ghrelin 与生殖的研究进展  18-27
  1 Ghrelin 的发现背景及命名  18
  2 Ghrelin 及其受体的分子结构  18-20
    2.1 Ghrelin 的分子结构  18-19
    2.2 Ghrelin 受体GHS-R 的分子结构  19-20
  3 Ghrelin 在体内的分布  20
  4 Ghrelin 的生理功能  20-27
    4.1 调节生长素的分泌  20-21
    4.2 调节胃肠道功能  21
    4.3 调节摄食和能量代谢  21-22
    4.4 调节心血管系统功能  22
    4.5 对生殖的调节作用  22-27
      4.5.1 调节激素分泌  22-23
      4.5.2 对生殖细胞的调节  23-25
      4.5.3 调节胚胎发育  25
      4.5.4 调节动物发情  25-27
研究论文 Ghrelin 对大鼠下丘脑-垂体-性腺的影响及其机理研究  27-89
  引言  27-28
  第一章 Ghrelin 及其功能性受体GHS-R_(1a)在大鼠下丘脑-垂体-性腺上的定位  28-38
    前言  28
    1 材料与方法  28-30
      1.1 试验材料  28-29
        1.1.1 试验动物  28
        1.1.2 主要试剂  28-29
        1.1.3 溶液的配制  29
        1.1.4 主要仪器设备  29
      1.2 试验方法  29-30
        1.2.1 试验动物处理  29
        1.2.2 组织切片制作  29
        1.2.3 免疫组织化学步骤  29-30
        1.2.4 观察并拍照  30
    2 结果  30-35
      2.1 Ghrelin 在下丘脑-垂体-性腺轴上的定位  30-32
        2.1.1 Ghrelin 在下丘脑上的定位  30-31
        2.1.2 Ghrelin 在垂体上的定位  31
        2.1.3 Ghrelin 在睾丸上的定位  31-32
        2.1.4 Ghrelin 在卵巢上的定位  32
      2.2 GHS-R_(1a) 在大鼠下丘脑-垂体-性腺轴上的定位  32-35
        2.2.1 GHS-R_(1a) 在下丘脑上的定位  32-33
        2.2.2 GHS-R_(1a) 在垂体上的定位  33
        2.2.3 GHS-R_(1a) 在卵巢上的定位  33-34
        2.2.4 GHS-R_(1a) 在睾丸上的定位  34-35
    3 分析与讨论  35-37
      3.1 关于Ghrelin 在下丘脑、垂体、性腺中的分布  35-36
      3.2 关于Ghrelin 受体在下丘脑、垂体、性腺中的分布  36-37
    4 小结  37-38
  第二章 Ghrelin mRNA 在大鼠下丘脑-垂体-性腺上的表达  38-45
    前言  38
    1 材料与方法  38-41
      1.1 试验材料  38-39
        1.1.1 试验动物  38-39
        1.1.2 主要试剂  39
        1.1.3 溶液的配制  39
        1.1.4 主要仪器设备  39
      1.2 试验方法  39-41
        1.2.1 试验动物处理  39
        1.2.2 组织切片制作  39-40
        1.2.3 地高辛标记的Ghrelin 寡核苷酸探针序列  40
        1.2.4 切片的原位杂交检测  40
        1.2.5 观察并拍照  40-41
    2 结果  41-43
      2.1 Ghrelin mRNA 在大鼠下丘脑上的表达  41
      2.2 Ghrelin mRNA 在大鼠脑垂体上的定位  41
      2.3 Ghrelin mRNA 在大鼠睾丸上的表达  41-42
      2.4 Ghrelin mRNA 在大鼠卵巢上的表达  42-43
    3 分析与讨论  43-44
      3.1 关于Ghrelin mRNA 在下丘脑中的表达  43
      3.2 关于Ghrelin mRNA 在垂体中的表达  43
      3.3 关于Ghrelin mRNA 在睾丸中的表达  43-44
      3.4 关于Ghrelin mRNA 在卵巢中的表达  44
    4 小结  44-45
  第三章 Ghrelin 及其受体mRNA 在不同发情周期中的表达  45-56
    前言  45-46
    1 材料与方法  46-50
      1.1 试验材料  46-47
        1.1.1 试验动物  46
        1.1.2 主要试剂  46
        1.1.3 溶液的配制  46
        1.1.4 主要仪器设备  46-47
        1.1.5 组织取材  47
      1.2 试验方法  47-50
        1.2.1 大鼠发情各阶段的阴道组织涂片观察  47-48
        1.2.2 总RNA 的提取  48
        1.2.3 RNA 完整性检测  48
        1.2.4 RNA 浓度和纯度测定  48-49
        1.2.5 引物的设计与合成  49
        1.2.6 逆转录  49
        1.2.7 实时荧光定量PCR  49-50
        1.2.8 统计分析  50
    2 结果  50-53
      2.1 标准曲线与溶解曲线  50-51
      2.2 Ghrelin mRNA、GHS-R_(1a) mRNA 在下丘脑上的表达  51
      2.3 Ghrelin mRNA、GHS-R_(1a) mRNA 在脑垂体上的表达  51-52
      2.4 Ghrelin mRNA、GHS-R_(1a) mRNA 在卵巢上的表达  52-53
    3 分析与讨论  53-55
      3.1 Ghrelin mRNA 在生殖轴中的表达  53-54
      3.2 GHS-R_(1a) mRNA 在生殖轴中的表达  54-55
    4 小结  55-56
  第四章 侧脑室注射Ghrelin 对大鼠促性腺激素和性腺激素分泌的影响  56-67
    前言  56-57
    1 材料与方法  57-60
      1.1 试验材料  57
        1.1.1 试验动物  57
        1.1.2 主要试剂  57
        1.1.3 溶液的配制  57
        1.1.4 主要仪器设备  57
      1.2 试验方法  57-60
        1.2.1 试验动物的分组与处理  57-58
        1.2.2 大鼠的侧脑室注射  58
        1.2.3 血样的采集  58
        1.2.4 促性腺激素的测定  58-59
        1.2.5 性腺激素的测定  59
        1.2.6 统计分析  59-60
    2 结果  60-62
      2.1 不同剂量Ghrelin 侧脑室注射对成年雄性大鼠LH、FSH、T 分泌的影响  60
        2.1.1 对LH 的影响  60
        2.1.2 对FSH 的影响  60
        2.1.3 对T 的影响  60
      2.2 不同剂量Ghrelin 侧脑室注射对发情后期雌性大鼠LH、FSH、E_2、P_4 分泌的影响  60-61
        2.2.1 对LH 的影响  60
        2.2.2 对FSH 的影响  60
        2.2.3 对E_2 的影响  60
        2.2.4 对P_4 的影响  60-61
      2.3 111mol Ghrelin 侧脑室注射对不同发情周期雌性大鼠LH、FSH 分泌的影响  61-62
        2.3.1 对LH 的影响  61
        2.3.2 对FSH 的影响  61-62
      2.4 3 nmol Ghrelin 侧脑室注射对不同发情周期雌性大鼠E_2、P_4 分泌的影响  62
        2.4.1 对E_2 的影响  62
        2.4.2 对P_4 的影响  62
    3 分析与讨论  62-66
      3.1 Ghrelin 对促性腺激素分泌的影响  62-64
      3.2 Ghrelin 大鼠性腺激素分泌的影响  64-66
    4 小结  66-67
  第五章 侧脑室注射 Ghrelin 对大鼠促性腺激素释放激素、促性腺激素mRNA、性腺激素受体mRNA 表达的影响  67-80
    前言  67
    1 材料与方法  67-69
      1.1 试验材料  67-68
        1.1.1 试验动物  67
        1.1.2 主要试剂  67
        1.1.3 溶液的配制  67
        1.1.4 主要仪器设备  67-68
        1.1.5 组织取材  68
      1.2 试验方法  68-69
        1.2.1 总RNA 的提取  68
        1.2.2 RNA 完整性检测  68
        1.2.3 RNA 浓度和纯度测定  68
        1.2.4 逆转录方法  68
        1.2.5 引物设计  68-69
        1.2.6 实时荧光定量PCR  69
        1.2.7 统计分析  69
    2 结果  69-76
      2.1 标准曲线与溶解曲线  69-71
      2.2 侧脑室注射 Ghrelin (1nmol)对不同发情周期雌性大鼠GnRH mRNA 表达的影响  71-72
      2.3 侧脑室注射Ghrelin（1nmol）对不同发情周期雌性大鼠LH、FSH mRNA 表达的影响  72-73
        2.3.1 对LH mRNA 表达的影响  72
        2.3.2 对FSH mRNA 表达的影响  72-73
      2.4 不同剂量 Ghrelin 侧脑室注射对发情后期雌性大鼠 LH、FSH mRNA 表达的影响  73
        2.4.1 对LH mRNA 表达的影响  73
        2.4.2 对FSH mRNA 表达的影响  73
      2.5 侧脑室注射Ghrelin 对不同发情周期大鼠ER_β、PR_(A+B) mRNA 表达的影响  73-74
        2.5.1 对ER_βmRNA 表达的影响  73
        2.5.2 对PR_(A+B) mRNA 表达的影响  73-74
      2.6 不同剂量的 Ghrelin 侧脑室注射对发情后期大鼠对卵巢 ER_β、PR_(A+B) mRNA 表达的影响  74-75
        2.6.1 对ER_βmRNA 表达的影响  74
        2.6.2 对PR_(A+B)mRNA 表达的影响  74-75
      2.7 侧脑室注射不同剂量的 Ghrelin 对雄性大鼠ARmRNA.表达的影响  75
      2.8 侧脑室注射Ghrelin，大鼠垂体促性腺激素mRNA 表达丰度与血清促性腺激素浓度的相关性分析  75-76
    3 分析与讨论  76-79
      3.1 侧脑室注射 Ghrelin 对促性腺激素释放激素mRNA 表达的影响  76
      3.2 侧脑室注射Ghrelin 对促性腺激素mRNA 表达的影响  76-77
      3.3 侧脑室注射Ghrelin 对性腺激素受体mRNA 表达的影响  77-79
    4 小结  79-80
  第六章 Ghrelin 在体外对大鼠性腺激素分泌及其受体mRNA 表达的影响  80-89
    前言  80
    1 材料与方法  80-83
      1.1 试验材料  80-82
        1.1.1 试验动物  80
        1.1.2 主要试剂  80-81
        1.1.3 溶液的配制  81
        1.1.4 主要仪器设备  81-82
      1.2 试验方法  82-83
        1.2.1 性腺激素的测定  82
        1.2.2 实时定量PCR 试验部分  82
        1.2.3 细胞的制备与培养  82-83
        1.2.4 统计分析  83
    2 结果  83-85
      2.1 不同浓度的Ghrelin 对孕酮、雌激素分泌的影响  83-84
        2.1.1 对P_4 的影响  83
        2.1.2 对E_2 的影响  83-84
      2.2 不同浓度的Ghrelin 对睾丸间质细胞睾酮分泌的影响  84
      2.3 不同浓度的Ghrelin 对PR_(A+B) mRNA、ER_βmRNA 表达的影响  84-85
        2.3.1 对PR_(A+B) mRNA 的影响  84
        2.3.2 对ER_βmRNA 的影响  84-85
      2.4 不同浓度的Ghrelin 对睾丸间质细胞AR mRNA 表达的影响  85
    3 分析与讨论  85-87
      3.1 体外条件下Ghrelin 对E_2、P_4、T 分泌的影响  85-87
      3.2 体外条件下Ghrelin 对ER_βmRNA、PR_(A+B) mRNA、AR mRNA 表达的影响  87
    4 小结  87-89
全文结论  89-90
本课题的创新点和对课题的进一步设想  90-91
  1. 从分子角度进一步阐明 Ghrelin 及其受体在大鼠精母细胞、卵母细胞中的表达 规律,  90
  2. GHS-R_(1b) 以及其它亚型的主要生理功能  90
  3. Ghrelin 对生殖轴的作用机理有待于进一步探索  90
  4. Ghrelin 在家畜体内的分布和表达，从而为畜牧业生产提供理论指导  90-91
参考文献  91-102
致谢  102-104
作者简介  104-105
读期间发表论文  105

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