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柔嫩艾美耳球虫比较蛋白组及免疫蛋白组研究

作　者: 刘立恒
导　师: 李祥瑞
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 柔嫩艾美耳球虫比较蛋白组学免疫蛋白组学未孢子化卵囊孢子化卵囊第二代裂殖子免疫原性蛋白
分类号: S852.7
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

鸡柔嫩艾美耳球虫是艾美耳属最重要的虫种之一,它能专一性感染鸡。鸡感染球虫后,轻则造成体重减轻,肉料比下降并且并发血便；重则使鸡大批死亡,给养禽业带来严重的经济损失。柔嫩艾美耳球虫的某些专一性蛋白在寄生虫发育的特定阶段发挥着重要的作用。我们采用二维电泳方法,使用pH3-10线性胶条对柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊两个时期的可溶性蛋白进行了比较分析。凝胶通过考马斯亮蓝G-250染色并用ImageMasterTM图像分析软件分析,发现柔嫩艾美耳球虫卵囊蛋白丰度和种类在孢子化过程中发生了较大变化。选择18个在两个时期均出现的蛋白点；15个只在未孢子化卵囊阶段出现的蛋白点和21个仅出现于孢子化卵囊阶段的蛋白点通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)和串联质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)分析,将分析结果利用’Mascot’server和’Mascot in house’search engine,分别通过NCBI数据库和柔嫩艾美耳球虫蛋白序列数据库检索。有43个蛋白点能检索到柔嫩艾美耳球虫已知或与复顶门其它寄生虫或四膜虫具有同源性的蛋白。其中烯醇酶、肌动蛋白解聚因子、核糖体蛋白大亚基和19Kd子孢子抗原在未孢子化卵囊阶段丰度小于孢子化卵囊阶段,而乳酸脱氢酶丰度在未孢子化卵囊阶段高于孢子化卵囊阶段。柔嫩艾美耳球虫的丙酮酸激酶、假定蛋白、甘露醇磷酸化酶、天冬氨酸蛋白酶和14-3-3蛋白以及7个与复顶门其它寄生虫或四膜虫具有同源性的蛋白仅发现于未孢子化卵囊阶段,它们包括间日疟原虫假定蛋白和6-磷酸果糖激酶、四膜虫多腺苷酸结合蛋白、隐孢子虫蛋白酶亚基、环形泰勒虫假定分泌蛋白、弓形虫真核转录起始因子等。仅存在于柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊阶段的蛋白包括子孢子抗原、柔嫩艾美耳球虫未知蛋白和表面抗原10等已知的柔嫩艾美耳球虫蛋白和4个与复顶门其它寄生虫或四膜虫具有同源性的蛋白。它们包括四膜虫胞质动力蛋白、假定蛋白、膜骨架蛋白等。采用比较蛋白组学研究方法,选择柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和第二代裂殖子两个阶段的可溶性蛋白进行二维电泳分析,构建了稳定的二维电泳参考图谱。凝胶经染色和图像分析,发现在两个时期凝胶上平均分布有678、660个蛋白点。有14个蛋白点在两个时期均恒定表达。8个蛋白点经分析和数据库检索后鉴定为包括乳酸脱氢酶、19KD子孢子抗原、微线蛋白-2、烯醇酶和肌动蛋白解聚因子在内的已知柔嫩艾美耳球虫蛋白和1个与环形泰勒虫蛋白酶亚基具有同源性的蛋白。为了进一步了解柔嫩艾美耳球虫的免疫机制,本实验采用了免疫蛋白组学的方法,对柔嫩艾美耳球虫生活史中三个不同阶段的可刺激宿主产生抗体的蛋白分别进行了筛选,以期发现新的免疫原性蛋白。运用免疫蛋白组学方法鉴定了柔嫩艾美尔球虫未孢子化卵囊具免疫原性蛋白。约101个蛋白点被鸡抗柔嫩艾美耳球虫血清识别。根据其中46个蛋白点分析结果,有14个蛋白点被鉴定为柔嫩艾美尔球虫已知蛋白,这些蛋白包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、肌动蛋白解聚因子、免疫球蛋白重链结合蛋白、丙酮酸激酶、β微管蛋白、柔嫩艾美耳球虫假定蛋白、子孢子抗原等。17个蛋白点鉴定为与复顶门其它寄生虫或草履虫和四膜虫具有同源性的蛋白(包括堆型艾美耳球虫热休克蛋白、草履虫假定蛋白、疟原虫假定蛋白和6-磷酸果糖激酶等)。将剩余蛋白点的分析数据通过’Mascot in house’ (version 2.1) search engine利用柔嫩艾美尔球虫蛋白数据库检索,检索到12个未知的推测蛋白。将该蛋白氨基酸序列与NCBI蛋白数据库比对,发现9个与复顶门其他寄生虫具有同源性的蛋白。它们包括：弓形虫3-磷酸甘油醛脱氢酶、真核生物翻译起始因子和肌球蛋白A；间日疟原虫SNF2家族N末端封闭蛋白；牛巴贝斯虫肌球蛋白B和延胡索酸酶；环形泰勒虫假定分泌蛋白；小泰勒虫丙酮酸脱氢酶β亚基和隐孢子虫蛋白酶亚基等。采用免疫蛋白组学方法以人工感染鸡柔嫩艾美耳球虫制备的高免血清为一抗,对鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊可溶性蛋白的免疫原性进行了系统分析。约有80个具有免疫原性的蛋白点被抗血清识别。选择其中PVDF膜与凝胶匹配完全的40个点经质谱分析和NCBI数据库检索,有22蛋白点鉴定为柔嫩艾美耳球虫已知蛋白,包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微线蛋白、微管蛋白、子孢子抗原、表面抗原10、微线蛋白3、柔嫩艾美耳球虫未知蛋白、烯醇酰基还原酶和转氢酶等；另外还发现8个和复顶门其它寄生虫或草履虫具有同源性的蛋白,包括堆型艾美耳球虫RB1-a未知蛋白、隐孢子虫二氢叶酸还原酶合成酶以及草履虫假定蛋白等。将剩余的10个蛋白点分析数据通过柔嫩艾美耳球虫蛋白序列数据库进一步分析,8个由柔嫩艾美耳球虫基因组序列推测的未知蛋白被成功鉴定。将检测结果氨基酸序列比对(NCBI数据库),发现3个其它虫种蛋白与未知蛋白具有较高同源性,包括疟原虫ATP合成酶、弓形虫肌球蛋白A和丝盘虫的假定蛋白等。采用免疫蛋白组学方法,以人工感染鸡柔嫩艾美耳球虫制备的高免血清为一抗,对鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子可溶性蛋白具有免疫原性蛋白进行研究。有85个具有免疫原性的蛋白点被血清识别。选择其中PVDF膜与凝胶匹配完全的44个点进行质谱鉴定和NCBI数据库检索,26个蛋白点鉴定为柔嫩艾美耳球虫已知蛋白(包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微线蛋白、微管蛋白、表面抗原等),另有3个蛋白点的鉴定结果与堆型艾美耳球虫热休克蛋白、弓形虫Ⅰ型蛋白磷酸化酶和草履虫假定蛋白具有较高同源性。将剩余的15个蛋白点分析数据通过柔嫩艾美耳球虫蛋白序列数据库检索,发现11个由柔嫩艾美耳球虫基因组序列推测的未知蛋白。将检测结果氨基酸序列比对(NCBI数据库),除检索到1个柔嫩艾美耳球虫SAG12外,还检索到6个和其它虫种具有同源性的蛋白,它们包括弓形虫的膜骨架蛋白、线粒体F1-ATP合成酶β亚基受体,3-氧化酰基载体蛋白合酶和过氧化氢酶；恶性疟原虫Vp26蛋白和丝盘虫的假定蛋白等。

全文目录

摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
第一篇文献综述  14-40
  第一章鸡抗球虫保护性免疫机理及鸡球虫生物学  14-26
    1 鸡球虫的生物学  14-17
    2 鸡抗球虫免疫机理  17-23
    参考文献  23-26
  第二章蛋白组学在寄生虫研究上的应用  26-40
    1 蛋白组学的一般概念及内容  26-32
    2 二维电泳实验技术  32-36
    3 蛋白组学在寄生虫研究上的应用  36-38
    参考文献  38-40
第二篇试验研究  40-124
  第三章柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊比较蛋白组研究  40-57
    摘要  40-42
    1 材料与方法  42-44
    2 实验结果  44-46
    3 讨论  46-52
    4 小结  52-53
    参考文献  53-55
    Abstract  55-57
  第四章柔嫩艾美球虫孢子化卵囊与第二代裂殖子比较蛋白组研究  57-71
    摘要  57-58
    1 材料与方法  58-61
    2 结果  61-64
    3 讨论  64-67
    4 小结  67-68
    参考文献  68-70
    Abstract  70-71
  第五章柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊免疫蛋白组研究  71-91
    摘要  71-72
    1 材料和方法  72-75
    2 结果  75-83
    3 讨论  83-86
    4 小结  86-87
    参考文献  87-90
    Abstract  90-91
  第六章柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊免疫蛋白组研究  91-106
    摘要  91-92
    1 材料和方法  92-94
    2 结果  94-100
    3 讨论  100-102
    4 小结  102-103
    参考文献  103-105
    Abstract  105-106
  第七章柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子免疫蛋白组研究  106-124
    摘要  106-107
    1 材料和方法  107-109
    2 实验结果  109-112
    3 讨论  112-118
    4 小结  118-120
    参考文献  120-123
    Abstract  123-124
全文总结  124-126
本论文创新之处  126-128
致谢  128-130
论文发表情况  130

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