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虎纹捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及功能研究

作　者: 蒋立平
导　师: 梁宋平
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 虎纹捕鸟蛛 cDNA文库表达序列标签(EST) 基因组DNA 表达与纯化酵母双杂交
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 85次
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内容摘要

虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)是分布在我国云南和广西省的一种毒蜘蛛。它的毒液是由许多生物活性成份组成的复杂混合物,通过蛋白质组学和多肽组学方法从粗毒中已经鉴定了90种蛋白质和47种多肽,但这仅仅为粗毒中的部分高丰度组份。为了克隆虎纹捕鸟蛛毒腺中编码多肽和蛋白质的基因,我们使用表达序列标签(EST)技术,构建了毒腺的定向全长cDNA文库。随机测序后获得468个EST,通过聚类分析,可分成69个族：24个族是重叠群(每个群包括2个EST以上)和65个族是单态(每个族只包括1个EST)。通过生物信息学分析,其中68%的EST属于的毒素转录子；13%的EST属于细胞转录子；19%的EST属于新的转录子。所有毒素转录子编码67个开放读码框(ORF),即67个前体肽。根据前体肽序列的差异,除了HWTX-XI和HWTX-XIII外,它们能被分成8个超家族：即HWTX-Ⅰ超家族、HWTX-II超家族、HWTX-X超家族、HWTX-XIV超家族、HWTX-XV超家族、HWTX-XVI超家族、HWTX-ⅩⅦ超家族和HWTX-ⅩⅧ超家族。67个前体肽能被推导出43个成熟肽,序列中含半胱氨酸残基丰富,因此命名为半胱氨酸结毒素(CKT),其中31个是新的成熟肽。非毒素转录子编码41个蛋白质,它们是细胞蛋白质或别的非CKT分子,用真核生物正向同源群(KOG)和基因本体论(GO)注释了这些蛋白质。通过毒腺转录组学和毒液蛋白组学比较发现：仅仅15个CKT分子同时存在于毒腺转录组和毒液蛋白质组中；29个编码CKT的转录子只在转录组中被发现,而它们的翻译产物在毒液蛋白质组中没有被发现。用两种方法却没有鉴定到一个相同分子量的细胞蛋白质或其它毒液成分。此外,首次在蜘蛛毒腺中发现了一个编码EF-hand蛋白质(命名为HWEFHP1)的转录子重叠群,它功能可能与毒素从毒腺组织分泌到毒液有关。当前关于蜘蛛毒素基因组DNA的报道很少。为了深入的研究虎纹捕鸟蛛中编码毒素的基因组DNA是否具有普遍的无内含子特性,我们根据cDNA序列设计特异或简并的引物,克隆并分析了编码三个超家族毒素(HWTX-XI超家族、HWTX-ⅩⅦ超家族和HWTX-ⅩⅧ超家族)的DNA序列,结果发现它们的基因组DNA中都不存在内含子。此外,也从基因组DNA中克隆到19个编码毒素的新基因。为了尽可能多的鉴定到HWTX-XI的亚型,我们设计了简并引物,进行了定向PCR、克隆和进化分析。克隆到编码38个HWTX-XI前体肽亚型的cDNA序列,这是虎纹捕鸟蛛中成员最多的超级族,推导形成31个成熟肽；HW11c21、HW11c25、HW11c40、HW11c50和HW11c10等在HWTX-XI的进化上可能具有重要意义。随着环境的改变,蜘蛛的种类和数量越来越少,仅靠天然资源远不能满足对毒素的全面研究和开发利用的需要。采用表达质粒pVT102Uα在酿酒酵母S78中表达HWTX-XI的产率达到每升12.5mg。为了探讨这个表达系统是否能成一个表达蜘蛛毒素的通用系统,我们克隆并表达了20个编码毒素样多肽的基因。最后,成功的表达出11个毒素基因。对这些表达产物进行了初步的动物水平和细胞水平的功能研究。HW11c4在10μM的浓度下能抑制约50%的Kv1.1电流；HWTX-ⅩⅦbl在10μM的浓度下对大鼠DRG细胞上的高电压激活的钙通道有明显的抑制作用；HW11c4、HWllc27和HW11c27m对trypsin有很强的抑制作用,且对chymotrysin和thrombin也有明显的抑制作用；其它的表达产物活性很弱或者还没有找到生物学活性。此外,为从虎纹捕鸟蛛毒腺中筛选到与电压门控钠离子通道结合的因子,我们分别构建了虎纹捕鸟蛛的毒腺酵母双杂交cDNA文库和Nav1.8胞外区的Bait质粒,并进行了初步筛选。综上所述,利用分子生物学、生物信息学、生物化学、质谱和膜片钳等技术,我们对虎纹捕鸟蛛毒腺的转录组和基因组DNA进行了研究,克隆了一批有价值的新基因,表达并初步分析了4个有重要应用前景的毒素分子的功能。

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中文摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
第一章蜘蛛毒素基因的克隆与表达研究进展  13-33
  1.1 蜘蛛毒腺的结构  14-15
  1.2 蜘蛛毒液的成分  15-17
  1.3 蜘蛛毒素基因的克隆  17-22
    1.3.1 构建毒腺cDNA文库克隆毒素基因  18-20
    1.3.2 定向PCR克隆毒素基因  20
    1.3.3 通过RACE克隆毒素基因  20-22
  1.4 蜘蛛毒素基因的表达  22-33
    1.4.1 大肠杆菌表达系统  22-25
    1.4.2 酵母表达系统  25-27
    1.4.3 昆虫细胞表达系统  27-29
    1.4.4 植物表达系统  29-33
第二章虎纹捕鸟蛛毒腺转录组学研究  33-79
  2.1 基于虎纹捕鸟蛛转录子分析的分子多样性研究  33-58
    2.1.1 前言  33-35
    2.1.2 材料与方法  35-40
    2.1.3 结果  40-54
    2.1.4 讨论  54-58
  2.2 基于转录组学和蛋白质组学比较分析的虎纹捕鸟蛛的毒液组学研究  58-79
    2.2.1 引言  58-60
    2.2.2 材料与方法  60-61
    2.2.3 结果  61-72
    2.2.4 讨论  72-79
第三章虎纹捕鸟蛛毒素基因组学研究  79-95
  3.1 前言  79-80
  3.2 材料与方法  80-83
  3.3 结果  83-92
  3.4 讨论  92-95
第四章从虎纹捕鸟蛛毒腺中定向cDNA克隆、表达和鉴定Kunitz型毒素  95-131
  4.1 前言  95-96
  4.2 材料与方法  96-112
  4.3 结果  112-126
  4.4 讨论  126-131
第五章虎纹毒素多肽基因的真核表达、结构与功能分析  131-157
  5.1 前言  131-132
  5.2 材料与方法  132-141
  5.3 结果  141-151
  5.4 讨论  151-157
第六章利用酵母双杂交从虎纹捕鸟蛛毒腺中筛选与电压门控钠离子通道结合的因子  157-177
  6.1 前言  157-158
  6.2 材料与方法  158-171
  6.3 结果  171-174
  6.4 讨论  174-177
主要研究结果与进一步研究设想  177-181
参考文献  181-197
附录  197-199
攻读博士学位期间发表的论文目录  199-201
致谢  201-203

虎纹捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及功能研究

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