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家蚕尿苷二磷酸—葡萄糖基转移酶基因的功能研究

作　者: 黄飞飞
导　师: 鲁成
学　校: 西南大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕 尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶 表达模式 免疫组化 真核表达
分类号: Q96
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 120次
引　用: 2次
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内容摘要


糖基化作用在抑制和排除一系列内生和外源化合物的毒性方面起重要作用,尿苷二磷酸-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases,UGTs,EC 2.4.1.）参与催化这一反应。UGTs是一个多功能的超基因家族酶类,广泛分布于动物、植物、细菌和病毒中。UGTs的主要功能是将供体活化单糖尿苷二磷酸-糖（UDP-glycosyl）的糖基转移到受体底物上,主要包括尿苷二磷酸-葡萄糖（UDP-glucose）,尿苷二磷酸-半乳糖（UDP-galactose）,尿苷二磷酸-木糖（UDP-xylose）,尿苷二磷酸-葡糖醛酸（UDP-glucuronic acid）。使许多内生和外生的化合物发生糖基化作用,从而改变底物的性质,比如生物活性、溶解性和在细胞组织间转运的特性。UGTs主要分为植物类UGTs,哺乳动物类UGTs以及昆虫类UGTs。植物中的UGTs（UDP-glucosyltransferases,UGTs,EC 2.4.1.91）主要以UDP-葡萄糖作为糖供体,它使一系列化合物包括植物激素,植物的二级代谢产物和异生素例如杀虫剂等发生糖基化作用。哺乳动物的UGTs（UDP-glucuronosyltransferases,UGTs,EC 2.4.1.17）主要是以UDP-葡糖醛酸作为糖供体,它在抵御潜在的外源化学物质的侵害方面起重要作用,此外也参与许多内源化合物的代谢和平衡调节,包括胆红素和类固醇激素。与植物的UGTs相似,昆虫中的UGTs（UDP-glucosyltransferases,UGTs,EC 2.4.1.）也是以UDP-葡萄糖而不是UDP-葡糖醛酸作为糖供体。与哺乳动物相似,昆虫中许多内生和外源性化合物都发生了糖基化作用。昆虫中的UGTs在很多生理学过程中起重要作用,包括使酶作用的底物发生糖基化作用,特别是解除植食性昆虫食物中遇到的有毒的植物化合物的毒性方面起重要作用。此外还参与其它过程包括角质层的形成,色素沉着和嗅觉作用等方面。昆虫杆状病毒基因组中一个编码蜕皮甾醇UDP-葡萄糖基转移酶（ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,EGT 2.4.1.）的基因egt,是一个特殊的糖基转移酶基因。杆状病毒感染昆虫后生成的EGT酶可以催化昆虫体内UDP-葡萄糖中的葡萄糖基转移到蜕皮激素上,使蜕皮激素失活,从而阻滞寄主昆虫的蜕皮和化蛹,延长幼虫的取食时间,以利于病毒自身的大量繁殖。鳞翅目昆虫是农田的主要害虫,家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,也是目前唯一完成全基因组测序的鳞翅目昆虫。对家蚕UGTs基因进行全基因组分析与鉴定,不仅能为家蚕UGTs自身功能的研究,特别是解毒机制以及食性等方面研究提供分子基础,更重要的是它也可以为研究其它昆虫的UGTs基因提供重要参考。本研究利用家蚕的全基因组序列、ESTs数据以及基因芯片数据,对家蚕UGTs基因家族进行了生物信息学分析和表达模式的研究,同时采用克隆、RT-PCR、原核表达、免疫组化和真核表达等技术对该家族中的BmUGT013829基因的功能进行了探讨。本研究获得的主要结果如下:1.家蚕UGTs基因的生物信息学分析及表达模式的研究利用9×家蚕基因组数据,通过生物信息学分析,我们在家蚕基因组中共鉴定出了42个UDP-葡萄糖基转移酶基因,通过EST数据和基因芯片分析,总共有36个基因有表达证据。其中只有2个基因已有报道,其余40个基因为本研究首次鉴定。同其它昆虫相比,家蚕的UGTs基因数目明显增加（我们用同样的方法在按蚊中鉴定了22个UGTs基因,在蜜蜂鉴定了12个UGTs基因,已报道果蝇中有33个UGTs基因）。系统发生分析结果表明,家蚕基因组中存在有三群特有的UGTs基因,分别是GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅤ。家蚕UGTs基因的数目发生了膨胀并且产生了家蚕特有的UGTs基因,这可能是家蚕与它唯一的取食植物——桑叶之间长期相互竞争的结果。所鉴别的家蚕42个UGTs基因中都包含UGT基因典型的结构功能域:N端区域和C端区域,而且同早期对其它物种UGTs研究的结果一致,C端序列比N端序列保守性强。42个UGTs基因分布于10条染色体上,系统发生分析表明这些基因分为5大类群GroupⅠ-Ⅴ。每个群上的基因都表现出较高的序列相似性,表明这个家族在进化过程中发生了基因重复事件。相对于双翅目昆虫果蝇UGTs基因而言,家蚕UGTs基因的内含子数目较多,长度也较长,而家蚕UGTs基因所拥有内含子数目的增多可能是因为家蚕基因组中覆盖了大的重复序列。ESTs数据分析表明,家蚕UGTs基因中有24个基因具有EST证据。主要是在中肠、血液、丝腺、卵巢、精巢等组织具有转录活性,其中一些基因在滞育卵中有EST证据。芯片数据分析发现,UGTs基因中共有29个基因有探针序列。我们将这29个UGTs基因的不同组织芯片数据构建了聚类图。从图中可以看出绝大多数基因具有不同的表达模式。其中有16个基因在中肠组织中具有转录活性。BmUGT003817和BmUGT003835等基因在家蚕组织中广泛表达;一些基因呈组织特异性表达模式,如BmUGT004965和BmUGT010289基因只在丝腺组织中特异表达。RT-PCR结果与芯片数据分析的结果基本一致。BmUGT013835,BmUGT013859,BmUGT013830,BmUGT010286基顺在家蚕5龄3天的各个组织中广泛表达,仅在少数组织中不表达或表达量较低;BmUGT013860和BmUGT013834只在中肠组织中特异性表达;BmUGT010289和BmUGT004965只在丝腺组织中特异性表达。不论是从组织芯片数据还是RT-PCR的结果都表明,家蚕的UGTs基因表现出不同的表达模式。不同群的UGTs基因,组织分布存在差异,即使是发生了基因的重复事件,位于相同群的UGTs基因,组织表达情况也不相同。表明这些基因可能担负不同的功能。2.家蚕BmUGT013829基因的克隆、序列分析及表达谱研究我们对位于家蚕28号染色体上的BmUGT013829基因进行了克隆,获得了其完整的CDS序列。结果分析表明,该基因由四个外显子组成,CDS长度为1545bp,编码514个氨基酸,预测蛋白的分子量为57.5kDa,等电点为6.41。进一步的分析发现该基因编码的第1到16个氨基酸为信号肽序列,477-499氨基酸处为跨膜区域。在NCBI中检索,发现该基因与家蚕UGTs基因（登录号:DQ443275）的同源性最高,相似性为76%,其次与甲虫触角富含的UGTs基因（登录号:XM963911）的相似性为61%。基因芯片数据分析结果表明BmUGT013829基因在家蚕幼虫的头、脂肪体、体壁组织中有表达,其中在头组织中表达量很高。我们进一步使用RT-PCR技术检测发现,该基因在家蚕幼虫的头、脂肪体、体壁组织中有高量表达,而且在幼虫和成虫的触角组织中表达量非常高。说明此基因是触角富含的UGTs基因,可能参与嗅觉作用。除此之外,在中肠、丝腺、精巢、卵巢组织中也检测到了微弱表达。转录水平上的检测表明BmUGT013829基因的表达模式并不是嗅觉器官所特异的,除了有可能参与嗅觉作用外,还可能具有其他功能。3.家蚕BmUGT013829基因的原核表达以及多克隆抗体的制备将BmUGT013829基因的完整编码区亚克隆到pET-28a-c（+）表达载体上,构建成重组表达质粒,转化到BL21表达菌株,通过IPTG诱导重组菌BmUGT013829/pET28a/BL21表达蛋白。表达得到一个约60kDa的重组蛋白。目的蛋白分子量约为57.5kDa,加上6×His标签序列,约为60kDa,与预测分子量相符合。经蛋白组分鉴定发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式表达。通过亲和层析和电洗脱方法纯化原核表达的BmUGT013829蛋白,免疫兔子,制备抗体。利用Western blotting分析BmUGT013829蛋白在家蚕5龄3天组织中的表达情况,以检测抗体的有效性。结果表明BmUGT013829蛋白在脂肪体、头、体壁和中肠中都有表达,只是中肠的表达量很低。表明BmUGT013829蛋白在mRNA水平和蛋白质水平上都有表达,并且在mRNA水平和蛋白水平的表达情况相一致,头组织中表达量高,中肠组织表达量很低。而且Western blotting结果进一步表明我们所制备的抗体比较理想,可对BmUGT013829蛋白进行检测,可以进行下一步实验。4.家蚕BmUGT013829蛋白的免疫组化研究应用建立的石蜡切片技术体系,对家蚕5龄3天的头组织进行石蜡切片和H.E.染色。可以清楚的看到组织的各个组成成分,为后续实验结果的判定提供基础。家蚕头组织的免疫组化结果表明,BmUGT013829蛋白在头部组织的各个部分中部有表达,比如头部肌肉,只是在触角中的表达比在其它部何中高。推测家蚕BmUGT013829蛋白是触角富含的UGTs基因,可能参与家蚕嗅觉作用。除此之外很可能还具有其它功能,比如参与解毒等机制,因为BmUGT013829蛋白在体壁和脂肪体中高量存在（Western blotting结果）,而这两个组织是家蚕重要的解毒场所。5.家蚕BmUGT013829基因的真核表达和活性测定将BmUGT013829基因亚克隆到pFastBacTMMHT B真核表达载体,然后重组到Bacmid杆粒上,获得重组质粒Bacmid-BmUGT013829,在昆虫细胞中进行真核表达。Western blotting检测结果表明BmUGT013829在Sf9细胞中成功表达。我们选取P3代重组病毒液感染High Five细胞,以野生型Bacmid作对照。感染48h后,分别收集细胞沉淀,用来进行活性测定。为了鉴别BmUGT013829酶的活性,用属于不同化学群的底物对其进行了活性测定。经TLC检测结果表明BmUGT013829酶对一些气味物质（odorants）发生了糖基化作用,比如香草醛（vanillin）和丁香酚（guaiacol）,说明BmUGT013829酶参与嗅觉作用。除此之外,BmUGT013829酶还能够使酚类及其酚类衍生物包括黄酮类化合物（1-Naphthol,quercetin 3-β-D-glucoside）发生糖基化作用,说明BmUGT013829酶还参与解毒反应。

全文目录


摘要  9-13
ABSTRACT  13-18
第一章 文献综述  18-32
  1.1 植物UGTs的研究  18-22
    1.1.1 植物UGTs的分类和结构  19-20
    1.1.2 植物UGTs的作用位点  20-21
    1.1.3 植物UGTs的功能  21-22
  1.2 哺乳动物UGTs的研究  22-28
    1.2.1 哺乳动物UGTs的命名与分类  22-24
    1.2.2 哺乳动物UGTs的组织表达  24-25
    1.2.3 哺乳动物UGTs的底物特异性  25-26
    1.2.4 哺乳动物葡糖苷酸化的作用机制  26-27
    1.2.5 哺乳动物UGTs的功能  27-28
  1.3 昆虫UGTs的研究  28-32
    1.3.1 昆虫UGTs的结构和功能  28-29
    1.3.2 昆虫UGTs的研究现状  29-32
第二章 引言  32-36
  2.1 研究背景  32
  2.2 研究的目的和重要意义  32
  2.3 主要研究内容  32-34
  2.4 实验技术路线  34-36
第三章 家蚕UGTs基因的生物信息学分析及表达模式的研究  36-54
  3.1 材料与方法  36-40
    3.1.1 数据库和基因组序列  36-37
    3.1.2 分析的工具软件  37
    3.1.3 主要试剂  37-38
    3.1.4 分析方法  38-40
  3.2 结果与分析  40-51
    3.2.1 家蚕UGTs基因的鉴定  40-43
    3.2.2 家蚕UGTs超基因家族的系统发生分析  43
    3.2.3 家蚕UGTs超基因家族在基因组上的分布  43-46
    3.2.4 家蚕UGTs基因内含子的缺失和获得以及内含子的位置和大小  46-48
    3.2.5 家蚕UGTs基因在5龄3天组织中的表达模式  48-51
  3.3 讨论  51-54
    3.3.1 UGTs基因的数目  51
    3.3.2 UGTs基因的结构  51-52
    3.3.3 UGTs基因的功能  52-54
第四章 家蚕BmUGT013829基因的克隆及序列分析  54-68
  4.1 材料与方法  54-59
    4.1.1 实验材料  54
    4.1.2 主要试剂及配制  54-55
    4.1.3 主要仪器设备  55-56
    4.1.4 方法与步骤  56-59
  4.2 结果与分析  59-66
    4.2.1 家蚕BmUGT013829基因的克隆  59-60
    4.2.2 家蚕BmUGT013829基因的序列分析  60-64
    4.2.3 家蚕BmUGT013829基因在各组织中的表达  64-66
    4.2.4 家蚕BmUGT013829基因组织芯片表达谱分析  66
  4.3 结论与讨论  66-68
    4.3.1 家蚕BmUGT013829基因的克隆和序列分析  66-67
    4.3.2 家蚕BmUGT013829基因的表达谱分析  67-68
第五章 家蚕BmUGT013829基因的原核表达以及多克隆抗体的制备  68-88
  5.1 材料和方法  68-81
    5.1.1 载体和菌株  68
    5.1.2 主要试剂与仪器  68-74
    5.1.3 实验方法  74-81
  5.2 结果与分析  81-86
    5.2.1 重组表达质粒的构建  81-82
    5.2.2 BmUGT013829/pET28a/BL21的诱导表达  82-83
    5.2.3 蛋白表达形式的鉴定  83
    5.2.4 蛋白表达条件的优化  83-84
    5.2.5 包涵体的提取与纯化  84
    5.2.6 蛋白质定量  84-85
    5.2.7 抗体的制备及纯化  85
    5.2.8 Western blotting  85-86
  5.3 结论与讨论  86-88
    5.3.1 外源蛋白在大肠杆菌中的表达特点  86-87
    5.3.2 抗体的制备与免疫印迹  87-88
第六章 家蚕BmUGT013829蛋白的免疫组化研究  88-96
  6.1 材料与方法  88-92
    6.1.1 家蚕品种及实验材料的获得  88
    6.1.2 主要仪器  88
    6.1.3 主要试剂的配制  88-89
    6.1.4 实验方法  89-92
  6.2 结果与分析  92-95
    6.2.1 家蚕头组织石蜡切片的H.E染色  92-93
    6.2.2 家蚕免疫组化技术体系的建立  93
    6.2.3 家蚕BmUGT013829蛋白的头组织定位  93-95
  6.3 结论与讨论:  95-96
    6.3.1 石蜡切片技术及免疫组化体系  95
    6.3.2 家蚕BmUGT013829蛋白的组织定位研究  95-96
第七章 家蚕BmUGT013829基因的真核表达和活性测定  96-108
  7.1 材料与方法  96-100
    7.1.1 载体和菌株  96
    7.1.2 主要试剂与仪器  96-97
    7.1.3 实验方法  97-100
  7.2 结果与分析  100-105
    7.2.1 BmUGT013829基因的克隆  100
    7.2.2 重组转座载体的构建和鉴定  100-101
    7.2.3 重组杆状病毒质粒的获取与鉴定  101-102
    7.2.4 重组杆状病毒质粒转染sf9细胞  102
    7.2.5 SDS-PAGE分析  102
    7.2.6 Western blotting检测  102-104
    7.2.7 BmUGT013829重组融合蛋白的粗酶活性测定  104-105
  7.3 结论与讨论  105-108
    7.3.1 外源蛋白在昆虫细胞中的表达特点  105
    7.3.2 家蚕BmUGT013829基因的真核表达  105
    7.3.3 酶活性测定方法  105-108
第八章 综合与结论  108-114
参考文献  114-124
附录  124-130
在读期间发表论文及参加课题  130-132
致谢  132-133

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中图分类: > 生物科学 > 昆虫学
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