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中华绒螯蟹促雄性腺素的分离纯化及结构预测

作　者: 胡宝华
导　师: 刘红
学　校: 上海海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 促雄性腺素中华绒螯蟹分离纯化 RACE技术蛋白结构生物信息学
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的经济蟹种,养殖规模大,经济效益高。但其基础理论研究显得较为匮乏,促雄性腺素(Androgenic gland hormone,AGH)作为中华绒螯蟹性别调控的重要激素,国内外未见其分离、纯化以及更深层次的报道。本研究通过分离、纯化获得中华绒螯蟹促雄性腺素纯品,并得到其cDNA全长序列,主要开展了如下工作:1、解剖获得中华绒螯蟹促雄性腺(Androgenic gland AG),经蛋白提取获得促雄性腺素初提物,将该初提物进行凝胶过滤层析,得到的凝胶过滤图谱和本实验室原有的实验结果相似,目的峰保持了较高的一致性;将凝胶过滤分离得到的组分经冷冻干燥浓缩后,进行SDS-PAGE检测,分别使用非氨银染法和考马斯亮蓝染色法,成功得到分子量大小约为15 KD的目的蛋白。2、将目的蛋白进行De-novel测序,得到了两条肽段的氨基酸序列,分别命名为肽段1、肽段2,分子量大小分别为1810.89 D和1198.69 D;根据肽段1的氨基酸序列设计简并引物,通过RACR技术首次获得了中华绒螯蟹促雄性腺素的全长cDNA序列,该序列由一个长度为94bp的5’UTR,一个390bp的开放阅读框(ORF)和一个235 bp的3’UTR组成,在3’-非编码区Poly(A)上游15bp处存在一保守的聚腺苷酸信号(AATAAA)。开放阅读框编码的蛋白质由129个氨基酸组成,命名为Es-AGH,分子量为14037.14 D,并且其中包含了用于设计简并引物的肽段1。3、利用生物信息学软件对目前已知的甲壳动物促雄性腺素前体(AGH precursor),类胰岛素促雄性腺因子(insulin-like AG factor)以及Es-AGH进行分析,探讨它们的氨基酸理化特性、信号肽、跨膜结构域、二级结构、motif等,并利用Phyre软件对其三级进行同源性收索。结果显示:促雄性腺素前体包含信号肽,存在跨膜结构域,并和信号肽同位。PDB库中没有找到匹配的motif。促雄性腺素前体的二级结构有比较高的相似性,都包含两个中心螺旋区。Phyre搜索显示,它们的三级结构匹配的均为胰岛素家族的蛋白,这也进一步证实了促雄性腺素前体和胰岛素原的相似性。Es-AGH预测结果并没有信号肽,但其二级结构显示其包含AGH precursor的功能螺旋区,这也初步验证了Es-AGH的可信性。本研究通过对中华绒螯蟹促雄性腺素分离纯化研究,得到纯品的促雄性腺素;并通过De-novel测序、RACE技术获得其全长cDNA序列,其所编码的蛋白命名为Es-AGH,由129个氨基酸组成;通过生物信息学技术,比较促雄性腺素前体和类胰岛素促雄性腺因子的结构特性,分析促雄性腺素前体和类胰岛素促雄性腺因子的保守性,以及二者的差异,并验证了Es-AGH的可信性。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
引言  9-11
第一章研究概况  11-22
  1. 促雄性腺  11-15
    1.1 促雄性腺的形态  11-12
    1.2 促雄性腺的结构  12-14
    1.3 促雄性腺的发生、发育  14-15
  2. 促雄性腺素  15-20
    2.1 AGH 的化学性质  15-16
    2.2 AGH 的结构  16-17
    2.3 AGH 的功能  17-18
    2.4 AGH 的分离、纯化  18
    2.5 促雄性腺素的生物活性检验  18-20
    2.6 AGH 的基因表达  20
  3. 胰岛素促雄性腺因子的研究  20-22
第二章中华绒螯蟹促雄性素的分离、纯化  22-32
  1. 材料与方法  22-24
    1.1 材料  22-23
    1.2 试验方法  23-24
  2. 结果  24-28
    2.1 AGH 的取样  24
    2.2 蛋白质的提取  24
    2.3 凝胶层析  24-27
    2.4 SDS-PAGE  27-28
  3. 讨论  28-32
    3.1 促雄性腺采集  28
    3.2 蛋白分离纯化方法选择  28-30
    3.3 促雄性腺素生物活性初步检测  30-32
第三章中华绒螯蟹促雄性腺素基因克隆及序列分析  32-45
  1. 材料与方法  32-37
    1.1 试剂、材料  32-33
    1.2 实验方法  33-37
  2. 结果  37-43
    2.1 De-novo 测序  37-39
    2.2 总RNA 的提取  39
    2.3 快速扩增cDNA 末端  39
    2.4 RACE 产物回收结果  39-40
    2.5 测序  40-43
  3. 讨论  43-45
    3.1 未知蛋白测序  43-44
    3.2 RACE 技术的应用  44-45
第四章甲克动物促雄性腺素结构预测分析  45-55
  1. 材料方法  45-46
    1.1 材料  45
    1.2 方法  45-46
  2. 结果分析  46-53
    2.1 氨基酸理化特性分析  46
    2.2 信号肽预测  46
    2.3 跨膜结构域预测  46-47
    2.4 二级结构预测分析  47
    2.5 motif 分析  47
    2.6 三级级结构分析  47-53
  3. 结论  53
  4. 讨论  53-55
    4.1 AGH 结构的保守性和差异性  53-54
    4.2 生物信息学对蛋白质结构和功能预测分析的应用  54-55
小结  55-56
参考文献  56-65
致谢  65

中华绒螯蟹促雄性腺素的分离纯化及结构预测

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