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人类胚胎干细胞/诱导型多潜能干细胞向功能成熟嗜酸性粒细胞分化的研究

作　者: 杨文钰
导　师: 竺晓凡
学　校: 北京协和医学院
专　业: 内科学
关键词: 嗜酸性粒细胞 人类胚胎干细胞 人类诱导型多潜能干细胞
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)及人类多潜能干细胞(human pluripotent stem cell, hiPSC)具有无限增殖及多向分化潜能,它们的建立不仅为再生医学研究提供丰富了的细胞来源,而且为建立疾病特异性模型,最终实现个体化治疗提供了可能。目前已有报道在体外条件下从hES/iPS诱导分化出成熟血细胞,他们具有与外周血细胞相似的形态和功能。嗜酸性粒细胞(Eosinophil)参与人体多种炎症反应,从hES/hiPS诱导分化出成熟嗜酸性粒细胞目前尚未报道。本研究从hES/hiPS出发,在体外条件下向功能成熟的嗜酸粒细胞诱导分化,并对嗜酸性粒细胞形态,表面及内部颗粒蛋白表达水平,趋化游走及颗粒释放功能等多方面进行研究。为深入了解嗜酸性粒细胞早期分化,成熟过程并建立嗜酸性粒细胞相关的疾病模型提供实验依据。研究方法：选取hESC和hiPSC未分化集落分别与经18Gyγ射线照射的小鼠主动脉-眭腺-中肾区(Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM)基质细胞共培养2周,回收共培养细胞加入干细胞因子(SCF),白细胞介素3(IL-3),白细胞介素6 (IL-6), Flt3配体(Flt3-ligand)等细胞因子进行悬浮培养4周,每周对悬浮培养细胞计数,May-Giemsa染色观察细胞形态,定期采用免疫荧光染色方法观察成熟嗜酸性粒细胞表面标记：嗜酸性粒细胞过氧化物酶(Eosinophil Peroxidase EPO),主要硷性蛋白(Major Basic Protein MBP)及嗜硷性粒细胞标记2D7,ProMBP1 (Pro-Major Basic Proteinl)表达水平,通过流式细胞学和RT-PCR方法观察细胞表面及细胞内部特异性抗原及颗粒蛋白基因表达水平,于悬浮培养第14,21天行透射电镜检查观察嗜酸性粒细胞胞浆内部特异性晶体结构,并进行嗜酸性粒细胞功能检测,观察hES来源嗜酸性粒细胞在不同浓度细胞因子作用下脱颗粒及趋化游走功能。结果：研究结果表明,hES/AGMS3共培养2周即可产生少量EPO阳性细胞,将此共培养细胞回收并进行悬浮培养4周可以获得大量高纯度EPO+嗜酸性粒细胞,且随着培养时间延长,EPO阳性率表达逐渐升高,从悬浮培养第7天56.4%上升到第21天的94.4%,而嗜碱性粒细胞表面标记2D7阳性率表达从62.8%下降至25.7%,研究证明hES来源嗜酸性粒细胞早期发育经历一特定阶段,此阶段细胞同时表达嗜酸性粒细胞(EPO, MBP)和嗜碱性粒细胞(2D7, ProMBPl)表面标记,随着细胞逐渐成熟嗜酸性粒细胞标记明显增加,而嗜碱性粒细胞标记阳性率逐渐减低。与外周血造血干细胞来源的嗜酸性粒细胞发育过程极为相似。流式细胞学观察成熟嗜酸性粒细胞表面标记Siglec-8表达水平,呈现时间依赖性模式(从液体培养第7天10.8%上升至21天91.3%),与EPO表达水平升高趋势相一致。透射电镜检查分析,悬浮培养第21天透射电镜下可见部分嗜酸性粒细胞特异性晶体结构,尽管此时晶体结构尚未完全形成。细胞功能检测发现,hES来源的高纯度成熟嗜酸性粒细胞在SIgA刺激下可释放嗜酸性粒细胞特异性颗粒蛋白EDN (Eosinophil derived neurotoxin),且嗜酸性粒细胞在fMLP,白细胞介素5(IL-5),嗜酸性粒细胞趋化因子(eoaxin)作用下具有趋化游走功能。我们采用同样细胞培养方法,对四株正常人来源hiPS细胞与AGMS3进行共培养-悬浮培养,研究发现四株hiPS均可以产生数量不等的EPO阳性嗜酸性粒细胞,其中201B7产生嗜酸性粒细胞数量与hES接近。结论：我们已成功的从hESC, hiPS诱导出大量高纯度功能成熟的嗜酸性粒细胞,其具有与外周血成熟嗜酸性粒细胞相似的表面标记及功能。在其分化成熟过程中经历—特定阶段同时携带嗜酸性和嗜硷性粒细胞特征,与外周血及脐带血干细胞来源嗜酸性粒细胞相同。Silec-8是一成熟嗜酸性粒细胞表面标记可以用来观察hES/hiPS来源嗜酸性粒细胞早期发生、发育及分化成熟过程。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-11
材料与方法  11-17
结果  17-28
补充数据  28-30
讨论  30-33
结论  33-34
参考文献  34-38
综述  38-46
  参考文献  41-46
附录一:常见英文缩写  46-47
附录二:在学期间发表论文及参加会议  47-49
致谢  49-50

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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