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C2/C3卤代酸脱卤酶的筛选及克隆表达

作　者: 林春娇
导　师: 杨立荣；吴坚平
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 卤代酸脱卤酶 2-氯丙酸 羟基乙酸 3-羟基丙酸 分子模拟
分类号: TQ925
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


脱卤酶是催化碳卤键断裂的一类酶,可用于合成制备医药、农药中间体,如D-乳酸、S-2-氯丙酸、D-2,3-二氯丙酸等。因此选择具有代表性的S-2-氯丙酸、羟基乙酸和3-羟基丙酸为模型化合物,研究卤代酸脱卤酶的催化特性和规律,具有重要的理论意义和应用前景。论文首先通过高通量筛选法分别获得产R-2-卤代酸脱卤酶,氯乙酸脱卤酶和3-氯丙酸脱卤酶的菌株,然后采用简并PCR-染色体步移法或基因组文库法获得基因,构建了能高效表达的重组菌,最后结合分子模拟研究脱卤酶的催化特性,具体研究内容如下：1)通过高通量筛选法,获得产R-2-卤代酸脱卤酶的假单胞菌ZJU26(Pseudomonas sp.ZJU26).利用简并PCR和染色体步移法获得N端缺失的R-2-卤代酸脱卤酶的基因片段(dehDIV).添加来自恶臭假单胞菌AJ1/23的R-2-卤代酸脱卤酶基因(hadD)的N端序列(24个氨基酸残基)到dehDIV获得了新的脱卤酶基因(dehDIV-R).将dehDIV-R亚克隆到pET30a(+)载体中,在E. coli BL21(DE3)中实现高效表达,获得了重组的R-2-卤代酸脱卤酶(rDehDIV-R).其酶学性质为：最适pH 9.0,最适反应温度60℃,Km为2.245 mM,酶比活为20.56 U/mg。以纯化后的rDehDIV-R为催化剂,催化100mM 2-氯丙酸,4h内转化率达50.5%,ees>99%。以已知结构的RS-2-卤代酸脱卤酶(PDB编号为3BJX)为模板,同源模建了DehDIV-R的三维结构。对接结果表明R-2-氯丙酸以较低能量结合到酶的活性位点上,决定其选择性的是位点Asn203。利用分子模拟的氨基酸突变功能将Asn203突变成不同空间位阻的氨基酸,结果显示Asn突变成空间位阻较小的丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)时酶活上升,立体选择性丧失；但突变成空间位阻更大的Gln时,可能由于Gln的羧基的氢键作用,使酶对S-2-CPA亲和力增加,导致活力和立体选择性都下降。该结果说明了Asn203在酶的对映体选择性的作用。2)采用高通量筛选获得高产氯乙酸脱卤酶的菌株假单胞菌CGMCC 3267 (Pseudomonas sp.CGMCC 3267).活性电泳显示该酶为S-2-卤代酸脱卤酶。利用S-2-卤代酸脱卤酶的高保守性部位设计引物,通过简并PCR获得了氯乙酸脱卤酶的基因(dehll-S).将dehll-S亚克隆到pET30a(+)载体上,在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)实现高效表达,获得了重组的氯乙酸脱卤酶(rDehⅡ-S).其酶学性质为：最适pH 9.5,最适反应温度为50℃,Km为0.97 mM,酶比活为10.3 U/mg。利用原始菌的Dehll-S、重组菌的rDehⅡ-S的粗酶液为催化剂,以氯乙酸为底物,获得的羟基乙酸纯度>99%。为了减轻反应过程中的Cl抑制问题,采用添加镁铝氧化物吸附C1-去来降低溶液中C1-的浓度。在优化的条件下：200 mM氯乙酸,添加0.02g/L镁铝氧化物,反应15h,转化率>99%,产物纯度>99%。同源模建获得了DehⅡ-S的三维结构。三维结构比对发现该酶的催化口袋较大范围暴露在溶剂中,决定其具有较快的催化速度,较广的底物范围。采用分子对接手段来研究酶的底物选择性。结果发现直链S-2-卤代烷酸(从氯乙酸到S-2-十八烷酸)可以结合到DehⅡ-S,且结合能随着碳链的增长而增加。但由于碳链的增长,可能会占据Arg41催化氯离子离去的通道,使酶活力下降。3)通过高通量筛选获得能够降解高浓度3-氯丙酸和3-氯丁酸的菌株芽孢杆菌CGMCC 4196(Bacillus sp.CGMCC 4196).代谢产物的定性定量分析证明了该脱卤机理为水解型。构建基因组文库筛选到阅读框大小为465bp的3-氯丙酸脱卤酶基因(dehⅢ)将dehⅢ亚克隆到pET30a(+)载体,在含有稀有密码子补充的宿主菌E. coli BL21codon plus(DE3)里有效表达,获得了重组3-氯丙酸脱卤酶(rDehⅢ).其酶学性质为：最适pH为7.0,最适反应温度为30℃,Km为3.213mM,酶比活为19.28 U/g。利用纯化的rDehⅢ为催化剂,催化3-氯丙酸水解脱卤制备3-羟基丙酸,产率>99%。以脯氨酸羟化酶(Tpal)为模板,得到DehⅢ的三维结构。利用SiteID及Surlex-Docking预测该酶的催化位点为Asp55, Arg77, Arg78等。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
目录  11-14
缩略词  14-15
第一章 绪论  15-34
  1.1 脱卤酶简介  15-16
    1.1.1 脱卤酶的起源  15
    1.1.2 脱卤酶的分类  15-16
  1.2 2-卤代酸脱卤酶的研究进展  16-20
    1.2.1 RS-2-卤代酸脱卤酶  16-18
    1.2.2 R-2-卤代酸脱卤酶  18-20
    1.2.3 S-2-卤代酸脱卤酶  20
  1.3 3-卤代酸脱卤酶的研究进展  20-23
  1.4 卤代酸脱卤酶的研究方法的进展  23-26
    1.4.1 新卤代酸脱卤酶基因的筛选  23-24
    1.4.2 脱卤酶的定向进化及理性设计  24-26
  1.5 脱卤酶的应用  26-32
    1.5.1 环境冶理  26-27
    1.5.2 S-2-氯丙酸的制备  27-30
    1.5.3 羟基酸的制备  30-31
    1.5.4 其他  31-32
  1.6 本课题的研究思路和主要内容  32-34
    1.6.1 研究思路  32
    1.6.2 研究内容  32-34
第二章 卤代酸脱卤酶菌株的高通量筛选及产物验证  34-52
  2.1 引言  34
  2.2 材料和方法  34-39
    2.2.1 试剂  34
    2.2.2 仪器  34
    2.2.3 培养基  34-35
    2.2.4 培养方法  35
    2.2.5 筛选方法  35-37
    2.2.6 卤代酸及产物测定方法  37
    2.2.7 菌属类鉴定方法  37-38
    2.2.8 液质分析方法  38
    2.2.9 粗酶抽提方法  38-39
    2.2.10 酶活测定  39
    2.2.11 β-羰基链烷酸显色法  39
  2.3 结果与讨论  39-50
    2.3.1 高通量筛选方法的建立  39-40
    2.3.2 产R-2-卤代酸脱卤酶菌株的筛选  40-45
    2.3.3 产氯乙酸脱卤酶菌株的选育  45-47
    2.3.4 产3-氯丙酸脱卤酶菌株的筛选  47-50
  2.4 本章小结  50-52
第三章 R-2-卤代酸脱卤酶的克隆表达及分子模拟  52-83
  3.1 引言  52-53
  3.2 材料和方法  53-62
    3.2.1 仪器、试剂、菌种、质粒及培养条件  53-54
    3.2.2 简并PCR获得部分序列  54-55
    3.2.3 染色体步移法获得R-2-卤代酸脱卤酶的完整基因  55-56
    3.2.4 dehDⅣ和dehDⅣ-R的克隆  56-59
    3.2.5 DehDⅣ和DehDⅣ-R的表达及纯化  59-61
    3.2.6 DehDⅣ和DehDⅣ-R的同源模建及分子对接研究  61-62
  3.3 结果与讨论  62-81
    3.3.1 R-2-卤代酸脱卤酶基因部分序列的获得  62-65
    3.3.2 染色体步移法获得R-2-卤代酸脱卤酶的两端序列  65-67
    3.3.3 DehDⅣ和DehDⅣ-R的克隆及表达纯化  67-73
    3.3.4 rDehDⅣ-R酶学性质研究  73-76
    3.3.5 DehDⅣ和DehDⅣ-R的同源模建  76-79
    3.3.6 DehDⅣ-R与底物2-CPA的分子对接研究  79
    3.3.7 DehDⅣ-R突变酶与底物R-2-氯丙酸和S-2-氯丙酸的分子对接  79-81
  3.4 本章小结  81-83
第四章 氯乙酸脱卤酶的克隆表达及分子模拟  83-97
  4.1 引言  83
  4.2 材料和方法  83
  4.3 结果与讨论  83-96
    4.3.1 氯乙酸脱卤酶基因的克隆  83-84
    4.3.2 重组氯乙酸脱卤酶的表达  84-88
    4.3.3 重组氯乙酸脱卤酶的纯化  88
    4.3.4 重组氯乙酸脱卤酶的酶学性考察  88-91
    4.3.6 氯乙酸脱卤酶的同源模建  91-93
    4.3.7 分子对接预测DehⅡ-S的底物选择性  93-96
  4.4 本章小结  96-97
第五章 3-氯丙酸脱卤酶基因筛选、克隆表达及分子模拟  97-112
  5.1 引言  97
  5.2 材料与方法  97-102
    5.2.1 试剂,菌种,材料与方法  97-98
    5.2.2 文库构建方法  98-101
    5.2.3 亚克隆  101
    5.2.4 稀有密码子分析  101-102
    5.2.5 不正确折叠分析  102
  5.3 结果与讨论  102-111
    5.3.1 质粒文库的构建  102-105
    5.3.2 3-氯丙酸脱卤酶的克隆及表达纯化  105-107
    5.3.3 rDehⅢ的酶学性质  107-108
    5.3.4 DehⅢ的同源模建及分子对接研究  108-111
  5.4 本章小结  111-112
第六章 C2/C3卤代酸脱卤酶的应用初步探索  112-124
  6.1 引言  112-113
  6.2 材料和方法  113
    6.2.1 2-CPA的对映体分析  113
  6.3 结果和讨论  113-122
    6.3.1 rDehDⅣ-R拆分2-CPA制备S-2-CPA  113-116
    6.3.2 氯乙酸脱卤酶用于氯乙酸脱卤制备羟基乙酸  116-121
    6.3.3 3-氯丙酸脱卤酶用于3-羟基丙酸的制备  121-122
  6.4 本章小结  122-124
第七章 结论与展望  124-128
  7.1 结论  124-126
    7.1.1 R-2-卤代酸脱卤酶  124-125
    7.1.2 氯乙酸脱卤酶  125-126
    7.1.3 3-氯丙酸脱卤酶  126
  7.2 建议和展望  126-128
参考文献  128-138
附录  138-146
作者简介及研究成果  146-147

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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