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抗早颗粒对雌性性早熟大鼠Kiss-1/GPR54mRNA表达的影响及临床研究

作　者: 叶进
导　师: 韩新民
学　校: 南京中医药大学
专　业: 中医儿科学
关键词: 性早熟抗早颗粒 Kiss-1 GPR54 荧光定量PCR技术达那唑促性腺激素释放激素大鼠
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：本文以达那唑诱导的雌性性早熟大鼠为模型,通过观察调控青春期发育的关键分子下丘脑Kiss-1基因衍生肽kisspeptin及其受体GPR54 (G-protein couped receptor 54)在青春期发育不同时期的表达规律,探讨kisspeptin/GPR54在青春启动时的作用；观察中药抗早颗粒对kisspeptin/GPR54表达的影响以及kisspeptin/GPR54在抗早颗粒治疗性早熟中的作用,进一步认识抗早颗粒的作用机制；抗早颗粒治疗特发性中枢性性早熟女童临床疗效观察,研究抗早颗粒对性早熟女童雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、胰岛素样生长因子(IGF-1)的影响,以及抗早颗粒改善性早熟女童的中医证候优势,探讨抗早颗粒的作用机制;评价抗早颗粒治疗本病的临床经济学意义。方法：(1)出生后3天的SD雌性大鼠,随母鼠共同饲养,随机分为正常对照A组(青春前期)、正常对照B组(青春早期)、实验A组(青春早期)、实验B组(青春中期)。实验组大鼠在出生后5日龄给予皮下注射300ug达那唑。采用荧光定量PCR技术分别观察青春期启动前(出生后23日龄)、青春期启动(阴门开启为标志)、青春期启动后(建立2个规则的性周期)大鼠下丘脑Kiss-l/GPR54mRNA的表达规律。(2)出生后3天的SD雌性大鼠,随母鼠共同饲养,随机分为正常组、模型组、曲普瑞林组、中药组(大剂量组、中剂量组、小剂量组),每组6只。模型组、曲普瑞林组和中药组大鼠在出生后5日龄给予皮下注射300ug达那唑。曲普瑞林组大鼠15日开始用曲普瑞林100ug/kg,皮下注射,1次/日,同时中药组灌胃中药,1次/日,大剂量60m1/kg,中剂量30ml/kg,小剂量15ml/kg。同时模型组给予生理盐水1ml/只灌胃。模型组大鼠建立第一个发情期后于动情前期将该动物处死,其余各组按1：1比例同时处死。计算卵巢指数和子宫指数,观察卵巢组织切片黄体的出现情况,ELISA法测定血清E2、LH、IGF-1水平,荧光定量PCR技术测定大鼠下丘脑GnRH/GnRH-RmRNA、Kiss-1/GPR54mRNA的表达变化,探讨抗早颗粒对Kiss-1/GPR54mRNA表达的影响及抗早颗粒治疗性早熟的作用机制。(3)临床观察将特发性中枢性性早熟女童随机分2组,中药组62例,西药组31例。中药组口服抗早颗粒每日1剂,温水冲100ml,分2次口服,连服6个月；西药组肌肉注射盐酸曲普瑞林(达菲林),按60-100ug/kg,28天1次,连续6个月。观察治疗前后两组的疗效,研究抗早颗粒改善性早熟女童的中医证候的优势,分析抗早颗粒对性早熟女童LH、FSH、E2、IGF-1的影响,以及性早熟女童体重指数(BMI)与E2、IGF-1的相关性,探讨抗早颗粒的作用机制；评价抗早颗粒治疗本病的临床经济学意义。结果：(1)实验组5日龄雌性大鼠皮下注射达那唑后,阴门开启和建立两个规则的性周期时间明显提前,卵巢和子宫的脏器指数较正常对照A组大鼠明显增加；青春期启动时下丘脑GnRHmRNA的表达水平较正常对照A组显著升高。正常对照A组(正常青春前期)、模型A组(青春期早期)、模型B组(青春期中期)的Kiss-1mRNA和GPR54mRNA的表达逐渐增高,提示Kiss-1/GPR54mRNA的表达与生长发育的各个时期密切相关。同时观察到青春期启动时正常大鼠下丘脑Kiss-1/GPR54mRNA表达增加,与GnRH的增加趋于同步。(2)观察到抗早颗粒可以降低性早熟模型大鼠血清E2、LH、IGF-1水平,治疗前后有非常显著性差异(P<0.01)。荧光定量PCR技术观察到中药高、中、低剂量组、曲普瑞林组大鼠下丘脑GnRH、Kiss-1及GPR54 mRNA含量明显降低,与模型组比较,有显著性差异(P<0.01)。表明抗早颗粒可下调性早熟模型大鼠下丘脑Kiss-1、GPR54及GnRHmRNA的表达。(3)临床观察中药组有效率达83.87%,西药组有效率87.09%,两组疗效无显著性差异(P>0.05),中药组与西药组疗效相当；两组治疗后显著降低患儿血清FSH, LH及E2水平,子宫卵巢明显回缩,第二性征消退。中药组可显著改善性早熟女童形体偏胖、面赤口渴、肢体困倦、大便干结等中医证候,与西药组比较,有显著性差异(P<0.05)。(4)临床经济学评价,成本-效价比中药组显著优于西药组。结论：(1)性早熟大鼠青春期启动时kisspeptin/GPR54的表达异常,下丘脑Kiss-1/GPR54 mRNA的表达水平增高,可能参与并促进大鼠下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)的提前启动,导致大鼠性早熟的发生。(2)抗早颗粒可通过下调下丘脑Kiss-1/GPR54mRNA的表达,抑制GnRH的释放,延缓性早熟大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的启动。(3)抗早颗粒临床与曲普瑞林疗效相当,可能对性早熟患儿下丘脑-垂体-性腺轴功能有抑制作用。成本-效价比中药组显著优于西药组,显示抗早颗粒中药有进一步研究开发推广的价值。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
英文缩略词表  12-13
前言  13-15
第一章理论研究  15-25
  1.性早熟的病因及发病机制  15-18
  2.特发性性早熟的治疗进展  18-20
  3.中医学研究  20-23
  4.实时荧光定量PCR的研究进展  23-25
第二章动物实验研究  25-48
  1. 实验材料  25-27
    1.1 动物  25
    1.2 主要试剂  25-26
    1.3 主要仪器  26-27
    1.4 手术器械  27
  2. 雌性性早熟大鼠下丘脑Kiss-1/GPR54在青春发育不同时期的表达规律  27-36
    2.1 实验方法  27-30
    2.2 数据处理与统计学分析  30-31
    2.3 实验结果  31-36
  3. 抗早颗粒对雌性性早熟大鼠下丘脑Kiss-1/GPR54表达的影响  36-46
    3.1 方法  36-38
    3.2 数据统计分析  38
    3.3 实验结果  38-46
  4 结论  46-48
第三章抗早颗粒治疗儿童性早熟的临床研究  48-68
  1. 研究内容及研究方法  48-55
    1.1 诊断标准及病情分级标准  48-50
    1.2 病例选择标准  50-51
    1.3 临床用药方案  51
    1.4 观察项目与要求  51-52
    1.5 临床试验步骤及要求  52-53
    1.6 疗效及安全性评价  53-55
    1.7 数据管理与统计分析  55
  2. 临床研究结果  55-66
    2.1 一般资料分析  55-60
    2.2 研究结果分析  60-65
    2.3 安全性指标及不良反应的分析  65-66
  3. 结论  66-68
第四章讨论  68-80
  1. 性早熟"实在痰火,虚在肾阴"  68-71
    1.1 病变脏腑主要在肾,涉及于脾  68-69
    1.2 嗜食廿肥,痰热内蕴  69
    1.3 肾阴不足,虚火内灼  69-70
    1.4 "痰""火"互结是性早熟的重要病机  70-71
  2. 性早熟模型的建立  71
  3. 雌性性早熟大鼠下丘脑Kiss-1/GPR54在青春发育不同时期的表达规律  71-73
  4. 化痰泻火法是性早熟的有效治疗方法  73-74
  5. 抗早颗粒方义解析  74-76
    5.1 药物功效  74-76
    5.2 方义  76
  6. 抗早颗粒对性早熟模型大鼠作用机制的探索  76-77
    6.1 抗早颗粒对性早熟模型大鼠LH、E_2激素水平的影响  76-77
    6.2 抗早颗粒对性早熟模型大鼠IGF-1的影响  77
    6.3 抗早颗粒对性早熟模型大鼠Kiss-1/GPR54的表达  77
  7. 抗早颗粒的临床经济学意义  77-78
  8. 小结  78
  9. 本课题的创新点  78-79
  10. 问题与展望  79-80
参考文献  80-85
攻读博士学位期间取得的研究成果  85-87
致谢  87-88
作者简介  88

抗早颗粒对雌性性早熟大鼠Kiss-1/GPR54mRNA表达的影响及临床研究

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