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脂肪酶催化芳基丙酸酯水解立体选择性调控方法

作　者: 金鑫
导　师: 林贤福
学　校: 浙江大学
专　业: 化学
关键词: 酶促水解反应立体选择性调控 2-芳基丙酸酯固定化酶
分类号: O643.32
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

酶促反应已经在诸多领域展现出不可替代的作用,对酶促反应进行调控,特别是对其立体选择性的调控也越来越为人所关注。因此,本论文以酶促立体选择性反应的消旋温度和转变温度为出发点,通过酶、底物和溶剂的变化对其立体选择性进行调控,同时将固定化技术引入到酶促反应中对酶的性质进行控制,拓展了这些调控方法在有机合成和分析化学领域的应用前景。论文主要研究了脂肪酶催化的酮洛芬酯水解反应的消旋温度(Tr)及其在立体选择性调控中的作用。实验考察了CRL、L-AYS和PPL等六种脂肪酶在水相中催化酮洛芬乙烯酯的水解反应,结果表明：不同的酶具有不同的消旋温度,最低的为PPL, Tr=28°C,最高为L-AYS, Tr= 51℃;温度高于Tr时选择S型底物,低于Tr时选择R型底物。实验还考察了反应介质对酮洛芬乙烯酯水解反应消旋温度的影响,亲水性的二氧六环有机溶剂的添加会使得Tr减小,甚至消失,使酶不能展现出立体选择性；而疏水性的异丙醚和异辛烷有机溶剂的添加会使Tr增大,甚至使酶在10～50℃范围内只展现出R选择性。对于CRL和L-AYS酶催化酮洛芬烷基酯在水相中的反应,Tr随着烷基链的增长,从甲酯的约20℃降低到丁酯的约-1℃,且选择性为S构型,但当反应温度低于Tr时,选择性无法从S构型反转到R构型。论文主要研究了三种单一溶剂体系和四种混合溶剂体系中MJL催化酮洛芬乙烯酯水解的立体选择性,在单一溶剂体系中展现出线性的Eyring历程和消旋温度,结果表明：水相中的Tr为4.3℃,而异丙醚和异辛烷则不展现出消旋温度,在实验温度范围内(10～50℃)均展现出R选择性；在混合溶剂体系中展现出非线性Eyring历程和转变温度(Tinv),并研究了溶剂比例对Tinv的影响,结果表明：在亲水性有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和丙酮与水的均相混合溶剂体系中,Eyring曲线的Tinv处立体选择性E值为极大值；而相反的,在疏水性有机溶剂异丙醚和异辛烷与水的两相混合溶剂体系中,E值则为极小值。在DMF/水的均相混合溶剂体系中,Tinv会随着DMF比例的增大而减小,从>50℃减小到<5℃,且在10～50℃范围内Eyring曲线发生了从熵控到焓控的反转过程：在DIPE/水的两相混合溶剂体系中,Tinv则不会随着DIPE比例的变化而发生明显改变,保持在25℃左右。论文主要研究了壳聚糖(Cs)对青霉素G酰化酶(PGA)固定化的影响,主要考察了PGA活性以及立体选择性的变化。Cs基材中固定化的PGA具有最高的体积活力(523 U/g),同时也具有最高的比活力(9.17 U/(g protein)),而聚乙烯亚胺和羧丙基壳聚糖基材中,体积活力只有300 U/g左右,比活力只有5 U/(g protein)左右。对于Cs基材复合载体的固定化PGA来说,比活力会随着Cs分子量的增加而增加,随着Cs去乙酰度和制备液酸度的增加而减小。通过壳聚糖膜对辣根过氧化物酶(HRP)的吸附研究得知,酶的吸附量主要由壳聚糖膜网络结构的疏松程度所决定,而酶的表观比活力则主要由壳聚糖对酶促反应中小分子的扩散限制作用决定的。因此,构筑的新型Cs涂覆D301树脂复合载体式固定化PGA的比活力可以提高到47.9U/(mg protein),体积活力也可达到1304 U/g。对于固定化PGA催化的酮洛芬乙烯酯和2-苯基丙酸乙烯酯水解反应来说,固定化基材的变化没有对反应的立体选择性造成明显的影响。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-13
第一章绪论  13-18
  1.1 溶剂对酶促反应立体选择性的调控  13
  1.2 酶促立体选择性反应的消旋温度和转变温度  13-14
  1.3 酶的固定化对酶促反应的调控  14-15
  1.4 本论文主要研究内容  15
  参考文献  15-18
第二章酶促反应立体选择性调控的研究进展  18-74
  2.1 酶促反应立体选择性的溶剂效应  19-34
    2.1.1 有机介质中的酶促反应概述  19-20
    2.1.2 溶剂对酶促反应立体选择性的调控作用  20-30
    2.1.3 酶促反应立体选择性溶剂效应的影响因素  30-34
  2.2 酶促立体选择性反应的热力学分析  34-48
    2.2.1 酶促立体选择性反应热力学分析概述  34-38
    2.2.2 酶促立体选择性反应中的消旋温度  38-44
    2.2.3 酶促立体选择性反应中的转变温度  44-48
  2.3 酶促2-芳基丙酸类药物的反应及其立体选择性的调控  48-55
    2.3.1 2-芳基丙酸类手性药物的酶促反应  48-50
    2.3.2 酶促2-芳基丙酸类药物反应立体选择性的调控  50-55
  2.4 酶的固定化及其对酶性质的影响  55-66
    2.4.1 酶固定化概述  55-56
    2.4.2 酶的固定化对酶促反应立体选择性的调控  56-61
    2.4.3 酶促反应中固定化酶活性的调控  61-66
  参考文献  66-74
第三章酮洛芬酯的酶促水解反应及立体选择性调控  74-103
  3.1 引言  74-75
  3.2 实验部分  75-79
    3.2.1 实验试剂  75-76
    3.2.2 实验仪器及方法  76
    3.2.3 酮洛芬酯的制备  76-78
    3.2.4 酮洛芬酯的酶促水解  78
    3.2.5 热力学分析  78-79
  3.3 酶对水解反应立体选择性的影响  79-84
    3.3.1 不同酶源的脂肪酶催化的酮洛芬乙烯酯的水解反应  79-81
    3.3.2 温度对脂肪酶催化酮洛芬乙烯酯水解反应的影响  81-83
    3.3.3 酶源对酮洛芬乙烯酯水解反应消旋温度的影响  83-84
  3.4 酮洛芬酯链结构对酶促水解反应的影响  84-87
    3.4.1 酯链结构对水解反应立体选择性的影响  84-85
    3.4.2 酯链结构对消旋温度的影响  85-87
  3.5 溶剂对酮洛芬乙烯酯水解反应立体选择性的调控  87-100
    3.5.1 不同反应介质中的酶促反应立体选择性  87-90
    3.5.2 溶剂对脂肪酶CRL催化反应消旋温度的影响  90-92
    3.5.3 脂肪酶L-AYS在不同介质中催化反应的消旋温度  92-93
    3.5.4 脂肪酶催化水解反应的焓-熵补偿效应  93-95
    3.5.5 混合溶剂比例对消旋温度的影响  95-100
  3.6 小结  100-101
  参考文献  101-103
第四章 2-芳基丙酸酯的MJL催化水解及其溶剂调控方法  103-124
  4.1 引言  103-104
  4.2 实验部分  104-109
    4.2.1 实验试剂  104-105
    4.2.2 实验仪器及方法  105
    4.2.3 2-芳基丙酸类药物的酯化  105-108
    4.2.4 2-芳基丙酸酯的酶促水解  108
    4.2.5 热力学分析  108-109
  4.3 单一溶剂对MJL催化水解立体选择性的影响  109-114
    4.3.1 不同的药物乙烯酯酶促水解反应的立体选择性  109-110
    4.3.2 酯链结构对酶促酮洛芬酯水解立体选择性的影响  110-111
    4.3.3 不同溶剂中MJL催化水解反应的立体选择性  111-112
    4.3.4 溶剂对MJL催化水解反应消旋温度的影响  112-114
  4.4 混合溶剂中MJL催化水解反应的立体选择性调控  114-118
    4.4.1 混合溶剂对酶促水解反应立体选择性的影响  114-115
    4.4.2 不同混合溶剂体系中酶促水解的转变温度  115-116
    4.4.3 混合溶剂比例对酶促水解转变温度和立体选择性的影响  116-118
  4.5 非线性Eyring体系中溶剂效应的溶质-溶剂簇模型  118-121
    4.5.1 溶质-溶剂簇模型对溶剂效应的解释  118-120
    4.5.2 溶质-溶剂簇模型中的转变温度及立体选择性调控  120-121
  4.6 小结  121-122
  参考文献  122-124
第五章复合壳聚糖载体与酶固定化及其性质调控  124-158
  5.1 引言  124-125
  5.2 实验部分  125-132
    5.2.1 实验试剂  125-126
    5.2.2 实验仪器及方法  126-127
    5.2.3 固定化载体及固定化酶的制备  127-129
    5.2.4 蛋白质含量及酶活性的测定  129-130
    5.2.5 青霉素G酰化酶催化的水解反应  130-131
    5.2.6 负载HRP的壳聚糖膜电极的制备及电化学性能测定  131-132
  5.3 不同材料修饰载体对固定化PGA性质的调控作用  132-138
    5.3.1 不同官能团的修饰材料对固定化PGA活性的影响  132-134
    5.3.2 不同壳聚糖分子对固定化PGA活性的影响  134-135
    5.3.3 固定化PGA催化水解反应的立体选择性  135-138
  5.4 一种高活性复合壳聚糖载体式固定化PGA  138-146
    5.4.1 树脂复合壳聚糖载体的制备及表征  138-139
    5.4.2 戊二醛的活化过程对固定化的影响  139-141
    5.4.3 酶固定化初始液的浓度对固定化的影响  141
    5.4.4 载体粒径对固定化的影响  141-142
    5.4.5 固定化PGA比活性的提高  142-143
    5.4.6 固定化PGA的稳定性  143-145
    5.4.7 固定化PGA催化2-苯基丙酸乙烯酯的水解反应  145-146
  5.5 壳聚糖膜的吸附固定化对辣根过氧化物酶的调控  146-154
    5.5.1 壳聚糖膜表面结构的变化  146-147
    5.5.2 壳聚糖膜表面的亲/疏水性  147-148
    5.5.3 不同性质壳聚糖膜的电化学传导性  148-150
    5.5.4 不同性质壳聚糖膜对酶吸附的影响  150-152
    5.5.5 辣根过氧化物酶负载在不同壳聚糖膜电极上的电化学性能  152-154
  5.6 小结  154-155
  参考文献  155-158
第六章总结  158-161
附录一实验原始谱图  161-173
附录二攻读博士期间的科研成果  173-175
致谢  175-177

脂肪酶催化芳基丙酸酯水解立体选择性调控方法

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