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洛伐他汀产生菌的原生质体融合育种

作　者: 林晓波
导　师: 李浩明；黄树林
学　校: 广东药学院
专　业: 病原生物学
关键词: Lovastatin 红曲霉土曲霉融合子 RAPD
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

洛伐他汀(lavostatin)是HMG- CoA(3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂(HMG- CoA -RI)类微生物药物,它可以有效的降低冠心病和心肌梗塞的发病率和死亡率。近年来虽然有很多相关洛伐他汀(lavostatin)基因工程育种研究的报道,但是由于洛伐他汀生产菌土曲霉和红曲霉的遗传背景不清楚,在实际中都还难以应用。而原生质体融合技术有具有重组频率高、可省去遗传标记、避免基因分离、纯化、酶切和拼接操作等优点,这对遗传背景不清楚的土曲霉和红曲霉的育种来说显得格外重要。不同代谢产物产生菌的融合子,有可能将它们的部分生物基因整合在一起产生新的杂合代谢产物,达到与用基因工程方法实现组合生物合成的相同目的。洛伐他汀主要用土曲霉(aspergillus terreus)和红曲霉(monascus rubber)经深层发酵制取,红曲霉(monascus rubber)不仅产生洛伐他汀(也称莫那可林K,monacolin K),而且产生据推测为洛伐他汀生物合成的中间产物的聚酮类物质莫那可林J、L、X,这些物质都是HMG-CoA-RI类物质,具有很强的降低胆固醇、调节血脂的功能。而且红曲霉在我国有着广泛的应用,在酿造红酒、制腐乳、肉制品着色及制备中药方面的应用已有悠久的历史,其调节血脂的功能在许多国家都得到认同。由于其发酵产品可直接用作食品添加剂,因此有着更广的应用面,并且易被人们接受。同时土曲霉是现在国内生产洛伐他汀的原始出发菌,它具有优良的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺。本项目将通过土曲霉和红曲霉原生质体融合技术,将土曲霉生产菌优良的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺和红曲霉他汀类化合物的结构多样性、色素产生能力以及长期实践证明的安全性结合起来,选育他汀类化合物和色素高产菌株,以及全新他汀类物质的产生菌。在理论上探讨用原生质体融合技术实现组合生物合成的可能性与途径,为实际生产选育目的化合物稳定、高产菌株。在本论文中研究考察了各种细胞裂解酶和渗透压稳定剂等条件对红曲霉和土曲霉的原生质体制备、灭活及融合的影响,同时采用不同的方法对红曲霉和土曲霉的DNA进行提取纯化,探讨了提取液中不同的EDTA浓度对DNA提取和RAPD-PCR的影响,同时采用27条随机引物分别对土曲霉、红曲霉和融合子的DNA进行RAPD-PCR,扩增产物用5%的聚丙烯酰胺电泳的进行分离,并采用紫外分光光度法对土曲霉、红曲霉和融合子2的发酵液进行Lovastatin含量测定。结果表明:土曲霉和红曲霉在加石英砂混合酶体系中获得的原生质体数最多,而最适宜的渗透压稳定剂为0.6 mol/L的NaCL。红曲霉和土曲霉的原生质体分别在紫外灯(18 W)下15cm照射50 min和60oC水浴下保持40 min灭活率达到100%。最适合红曲霉和土曲霉的原生质体融合的条件为20% PEG在28oC下处理15-20 min。采用氯化苄的方法能提到完整的DNA,20mM的EDTA浓度能得到较好的DNA模板和稳定的RAPD-PCR条带,RAPD-PCR结果显示融合子2号在红曲霉和土曲霉的原生质体融合时发生基因重组,并能稳定遗传。Lovastatin在246nm波长处有最大的吸收,融合子2产洛伐他汀的能力不及由原始出发菌土曲霉但是比红曲霉的能力由了一定的提高。从而为构建一株高产量的菌株做好基础。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-11
第一章文献综述  11-27
  1.1 HMG-CoA还原酶抑制剂  11-15
    1.1.1 HMG-CoA还原酶抑制剂  11-12
    1.1.2 HMG-CoA还原酶抑制剂基本结构与分类  12-13
    1.1.3 HMG-CoA还原酶抑制剂抑制机理  13-15
  1.2 洛伐他汀的研究进展  15-27
    1.2.1 洛伐他汀的结构与性质  15-17
    1.2.2 洛伐他汀的生物合成  17-19
    1.2.3 洛伐他汀的基因特性描述  19-20
    1.2.4 临床应用  20-21
    1.2.5 生产工艺研究  21-25
    1.2.6 提取与分离、纯化工艺  25-26
    1.2.7 研究意义与展望  26-27
第二章材料和方法  27-35
  2.1 材料、试剂和仪器  27-29
    2.1.1 实验的菌株  27
    2.1.2 试剂  27
    2.1.3 仪器  27-28
    2.1.4 溶液的配置  28-29
  2.2 实验方法  29-35
    2.2.1 土曲霉和红曲霉的菌株培养  29-30
    2.2.2 原生质体的制备  30
    2.2.3 原生质体的灭活  30-31
    2.2.4 原生质体的融合  31
    2.2.5 原生质体的融合子筛选  31
    2.2.6 土曲霉、红曲霉及融合子的DNA的提取和随机引物  31-32
    2.2.7 土曲霉、红曲霉及融合子的RAPD-PCR  32-34
    2.2.8 土曲霉、红曲霉及融合子的紫外分光光度法测定  34-35
第三章结果与讨论  35-43
  3.1 洛伐他汀产生菌的原生质体融合条件研究  35-38
    3.1.1 酶系统的选择  35
    3.1.2 最佳酶解温度及时间的确定  35-36
    3.1.3 渗透压稳定剂对原生质体形成的影响  36-37
    3.1.4 最佳灭活条件的确定  37
    3.1.5 最佳融合的时间及PEG浓度的确定  37-38
  3.2 洛伐他汀产生菌的原生质体融合子的筛选和鉴定  38-41
    3.2.1 融合子的筛选  38
    3.2.2 DNA提取的主要影响因素  38-40
    3.2.3 融合子的RAPD鉴定  40-41
  3.3 土曲霉、红曲霉及融合子的紫外分光光度法测定  41-43
结论  43-44
参考文献  44-50
硕士期间发表的论文  50-51
英文缩写词表  51-52
致谢  52

洛伐他汀产生菌的原生质体融合育种

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