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口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株（全长、缺失和置换）cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

作　者: 吕建亮
导　师: 张永光
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒全基因组感染性cDNA分子克隆嵌合病毒反向遗传学假结节核糖体内部进入序列
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

FMD(Foot-and-Mouth Disease ,FMD)是严重威胁世界畜牧业经济及人类健康的烈性传染病,是牛、羊、猪等主要畜种的头号杀手。该病病原FMDV(Foot-and-Mouth Disease virus,FMDV)属于小RNA病毒,具有高度的变异性和广泛的宿主谱,关于其致病的分子机制、抗原变异的分子机理和宿主嗜性,至今还不是十分清楚。为了研究其致病机制、抗原变异的分子机理和宿主嗜性,我们首次构建了FMDV牛源泛亚型O/CHINA/99株的3株不同感染性cDNA分子克隆。1. FMDV O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定设计并合成了覆盖O/CHINA/99株基因组的9条引物,从感染牛源O/CHINA/99株的乳鼠胴体中提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法分别扩增出4条目的基因片段(S、C、Z和E)。利用片段两端的限制性内切酶位点,将各基因片段分别插入到pOK12载体中,构建成O/CHINA/99株基因组的全长cDNA分子克隆。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK-21细胞,24h后可观察到典型的FMDV致细胞病变效应。分别使用RT-PCR法和乳鼠皮内接种法对拯救的病毒进行鉴定,结果表明拯救到了特定的FMDV。以上鉴定结果表明,我们已成功构建了O/CHINA/99株全长感染性cDNA分子克隆,并拯救出基因工程病毒。这将为研究FMDV基因组的结构与功能、探讨PMDV的分子致病机制以及宿主嗜性奠定了良好的基础。2. FMDV O/CHINA/99缺失毒株的全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定关于PKs的功能目前尚不太清楚,有报道称PKs与FMDV的宿主嗜性和毒力有一定的关系。为揭示FMDV翻译、分子致病机制以及阐明PKs基因缺失导致的病毒宿主嗜性改变的原因,我们设计并合成了O/CHINA/99株基因组5条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,成功构建0/CHINA/99缺失毒株全长cDNA分子克隆。并拯救出0/CHINA/99特定缺失的基因工程病毒,这为进一步探索FMDV致病的分子机制及宿主嗜性奠定了良好的基础。3.嵌合病毒pOKTAW97/CHINA99的全长cDNA分子克隆的构建和感染性鉴定IRES是蛋白翻译顺式作用元件,二级结构有4个结构域,IRES不依赖帽结构指导病毒蛋白合成。由于IRES的空间结构发生变化,而结合的宿主真核翻译起始因子不同,所以IRES在病毒翻译和宿主嗜性中发挥很重要的作用。为揭示FMDV蛋白翻译、分子致病机制以及阐明IRES空间结构改变导致的病毒宿主嗜性改变的原因,我们以牛源FMDV O/CHINA/99株的感染性cDNA为骨架,用猪源FMDV的IRES置换相应的区段,构建了FMDV型内嵌合病毒pOKTAW97/CHINA99的全长cDNA分子克隆,并得到置换IRES的嵌合病毒。这将为研究FMDV基因组的IRES的结构与功能、探讨FMDV的分子致病机制以及宿主嗜性创造了良好的条件。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章绪论  11-30
  1.1 研究背景、目的和意义  11-12
  1.2 国内外研究现状  12-18
    1.2.1 FMDV 5'UTR 的VPg  13
    1.2.2 FMDV 5'UTR 的假结节  13
    1.2.3 IRES在病毒翻译中的作用  13-15
    1.2.4 3'UTR 的功能及其与高级结构的关系  15-16
      1.2.4.1 3'UTR 对基因组复制的调控  15-16
      1.2.4.2 3'UTR对基因组翻译的调控  16
      1.2.4.3 3'UTR与蛋白质因子间复杂的相互作用  16
    1.2.5 影响FMDV宿主嗜性的基因  16-18
      1.2.5.1  17
      1.2.5.2  17
      1.2.5.3  17-18
  1.3 RNA 病毒的反向遗传学研究  18-29
    1.3.1 概述  18-19
    1.3.2 早期的反向遗传学的研究  19-20
    1.3.3 病毒反向遗传操作技术的建立  20-23
      1.3.3.1 构建病毒基因组全长cDNA克隆  20-21
      1.3.3.2 感染性转录物的产生  21-22
      1.3.3.3 从cDNA克隆拯救感染性病毒  22-23
    1.3.4 正链RNA 病毒的反向遗传学操作  23-24
    1.3.5 负链RNA 病毒  24-25
    1.3.6 影响构建感染性克隆的限制性因素  25-27
    1.3.7 感染性克隆的产生与鉴定  27
    1.3.8 病毒基因组功能的研究  27
    1.3.9 新型疫苗的研究  27-28
    1.3.10 基因治疗  28-29
  1.4 结语  29
  1.5 研究内容和方法  29-30
第二章口蹄疫病毒泛亚型0/CHINA/99 株全长cDNA 分子克隆构建和感染性鉴定  30-37
  2.1 材料与方法  30-32
    2.1.1 材料  30
    2.1.2 方法  30-32
      2.1.2.1 引物的设计与合成  30
      2.1.2.2 全长cDNA 的克隆和构建  30-32
      2.1.2.3 FMDV O/CHINA/99 株基因组全序列的扩增  32
  2.2 结果  32-35
    2.2.1 感染性克隆载体的鉴定  32-33
    2.2.2 体外转录物RNA的制备  33
    2.2.3 转染BHK-21细胞  33-34
    2.2.4 乳鼠实验结果  34-35
  2.3 讨论  35-37
第三章口蹄疫病毒泛亚型 0/CHINA/99 缺失毒株全长 cDNA 分子的克隆构建和感染性鉴定  37-45
  3.1 材料与方法  37-39
    3.1.1 毒株和工程菌  37
    3.1.2 主要工具酶及试剂盒  37-38
    3.1.3 5'端片设计与合成  38
    3.1.4 FMDV O/CHINA/99株基因组全序列的扩增  38
    3.1.5 全长cDNA的克隆和构建  38-39
  3.2 结果  39-43
    3.2.1 5'端缺失后序列的鉴定  39-40
    3.2.2 全长cDNA 构建和鉴定  40
    3.2.3 体外转录物 RNA 的制备  40-41
    3.2.4 转染BHK-21 细胞  41-42
    3.2.5 乳鼠试验结果  42
    3.2.6 功能未知区序列的空间结构  42-43
    3.2.7 5'UTR序列的比对  43
  3.4 讨论  43-45
第四章 FMDV型内嵌合病毒TAW97／CHINA 99的构建和感染性鉴定  45-56
  4.1 材料与方法  45-47
    4.1.1 O/CHINA/99 感染性cDNA 克隆  45
    4.1.2 主要工具酶及试剂盒  45-46
    4.1.3 突变序列的设计与合成  46
    4.1.4 O/CHINA/99 突变毒株全长cDNA 的克隆和构建技术路线（图1）  46-47
  4.2 结果  47-50
    4.2.1 嵌合重组质粒pOKTAW97/CHINA99 的鉴定结果  47
    4.2.2 线性化全长cDNA 的获得  47-48
    4.2.3 体外转录物RNA的制备  48
      4.2.3.1 体外转录  48
      4.2.3.2 转录产物的纯化  48
    4.2.4 转染BHK-21细胞  48-49
      4.2.4.1 细胞培养及处理  48
      4.2.4.2 制备RNA-阳离子脂质体试剂复合物  48-49
      4.2.4.3 转然细胞  49
    4.2.5 乳鼠实验结果  49-50
  4.3 IRES的空间结构及真核起始因子  50-54
    4.3.1 IRES空间结构  50-51
    4.3.2 FMDV翻译所涉及的细胞因子  51-54
  4.4 讨论  54-56
第五章研究结论  56-57
参考文献  57-65
致谢  65-66
作者简历  66

口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株（全长、缺失和置换）cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

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