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青海血蜱cDNA表达文库的免疫筛选及基因克隆表达

作　者: 李金杰
导　师: 殷宏；罗建勋
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 青海血蜱幼蜱阳性血清 青海血蜱成蜱cDNA表达文库 表达
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 60次
引　用: 1次
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内容摘要


青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)及其传播的疾病严重威胁着我国畜牧业的发展。目前,对蜱的控制方法主要是应用化学药物灭蜱,但随着蜱耐药性的产生以及环境污染和药物残留等严重公共卫生问题的出现迫使人们寻求防治的新途径。在众多控制蜱的方法中,免疫学防制是前景最诱人的方法之一。将青海血蜱成蜱cDNA表达文库与宿主菌BL21(DE3)pLysE按一定比例混合孵育并铺板,当噬斑出现后将NC膜覆盖于顶层胶表面并继续培养3.5 h。随后,将此NC膜依次与抗青海血蜱幼蜱阳性血清和碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG反应,最后加底物显色,初步筛选得到蓝紫色的阳性克隆,并复筛直至整个膜上均为阳性信号为止。用所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之自动亚克隆为重组质粒,用此亚克隆质粒转化宿主菌JM109并从中提取重组质粒进行PCR和测序。序列分析结果表明:共获得10个基因,分别命名为HqLA-1、HqLA-2、HqLA-3、HqLA-4、HqLA-5、HqLA-6、HqLA-7、HqLA-8、HqLA-9和HqLA-10,它们的大小分别为798bp、421bp、637bp、392bp、297bp、1473bp、626bp、201bp、989bp和551bp。其中HqLA-1～HqLA-9为青海血蜱所固有的新发现基因,提交至GenBank/NCBI获取序列号,序列号分别为FE674076、FE674077、FE674078、FE674084、FE674079、FE674080、FE674081、FE674082和FE674083。其中HqLA-2、HqLA-6、HqLA-7、HqLA-9和HqLA-10共5个基因成功进行诱导表达,表达产物的分子量为47kDa、87kDa、48kDa、57kDa和68kDa。利用表达产物蛋白能与抗青海血蜱幼蜱阳性血清发生免疫学反应,发现基因HqLA-7、HqLA-9的表达产物具有较好的反应原性。这为研制青海血蜱的分子疫苗奠定了基础。本研究利用兔抗青海血蜱幼蜱阳性血清对已构建的青海血蜱成蜱cDNA表达文库(高金亮构建)进行免疫学筛选,则所获得抗原基因在理论上对青海血蜱幼蜱和青海血蜱成蜱均具有保护性。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
第一章 引言  9-14
  1.1 研究目的与意义  9-10
  1.2 蜱功能基因的国内外研究现状  10-13
    1.2.1 蜱功能基因的分布  10-11
    1.2.2 与蜱唾液腺有关的功能性抗原  11-12
    1.2.3 与微小牛蜱免疫相关的功能性分子  12-13
    1.2.4 与长角血蜱有关的功能性抗原分子  13
  1.3 研究的内容和方法  13-14
第二章 文库的免疫学筛选和基因的克隆  14-23
  2.1 材料和方法  14-19
    2.1.1 实验动物  14
    2.1.2 试剂与实验用品  14
    2.1.3 仪器与设备  14-15
    2.1.4 阳性血清的制备  15-16
    2.1.5 cDNA文库的免疫学筛选  16-17
    2.1.6 阳性克隆的鉴定  17-19
  2.2 结果  19-20
    2.2.1 阳性克隆的筛选结果  19-20
    2.2.2 阳性克隆的测序结果  20
  2.3 讨论  20-23
第三章 阳性克隆原核表达及反应原性的初步鉴定  23-32
  3.1 材料和方法  23-28
    3.1.1 主要试剂  23
    3.1.2 主要仪器  23-24
    3.1.3 λSCREEN空白环形载体的制备  24
    3.1.4 目的基因的诱导表达  24-25
    3.1.5 表达产物的蛋白质电泳以及目的蛋白的检测  25-28
  3.2 结果  28-29
    3.2.1 重组质粒表达的蛋白质电泳结果  28-29
    3.2.2 免疫印迹结果  29
  3.3 讨论  29-32
第四章 新基因 HqLA-2 的克隆与测序  32-39
  4.1 材料  32-33
    4.1.1 主要试剂  32
    4.1.2 HqLA-2 的克隆引物  32-33
  4.2 方法  33-35
    4.2.1 青海血蜱幼蜱总RNA的提取  33-34
    4.2.2 HqLA-2 之5’一端的扩增  34-35
    4.2.3 RACE产物的克隆  35
    4.2.4 序列拼接  35
  4.3 结果与分析  35-37
    4.3.1 所提取总RNA琼脂糖凝胶电泳  35-36
    4.3.2 目的基因5’端的克隆结果  36
    4.3.3 目的基因序列的拼接  36-37
  4.4 讨论  37-39
    4.4.1 PCR特异性的改进  37
    4.4.2 RNA质量对RACE方法的影响  37
    4.4.3 目的片段克隆条件的优化  37-38
    4.4.4 HqLA—2 基因片段的选取  38-39
第五章 全文结论  39-40
  5.1 进行cDNA表达文库筛选并获得新基因  39
  5.2 对5 个基因进行了表达  39
  5.3 采用RACE方法获得了基因HqLA-2 的完整开放阅读框  39-40
参考文献  40-45
附录  45-70
  附录1 获取的序列号  45-47
  附录2 HqLA-1 登陆 GenBank/NCBI 记录情况  47-49
  附录3 HqLA-2 登陆 GenBank/NCBI 记录情况  49-51
  附录4 HqLA-3 登陆 GenBank/NCBI 记录情况  51-54
  附录5 HqLA-4 登陆 GenBank/NCBI 记录情况  54-56
  附录6 HqLA-5 登陆 GenBank/NCBI 记录情况..  56-58
  附录7 HqLA-6 登陆 GenBank/NCBI 记录情况  58-61
  附录8 HqLA-7 登陆 GenBank/NCBI 记录情况  61-63
  附录9 HqLA-8 登陆 GenBank/NCBI 记录情况  63-65
  附录10 HqLA-9 登陆 GenBank/NCBI 记录情况  65-68
  附录11 HqLA-2 全长基因登陆 GenBank/NCBI 记录情况  68-70
致谢  70-71
作者简历  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学
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