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武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体（BAC）文库构建

作　者: 王万群
导　师: 张克诚
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 武夷菌素 16S rDNA 高分子量DNA 细菌人工染色体文库
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

农用抗生素武夷菌素(Wuyiencin)是一种广谱、高效、低毒的核苷类农用抗生素,它对农作物的白粉病、番茄叶霉病、番茄灰霉病等真菌病害有良好的防治效果。目前武夷菌素产生菌经过诱变、原生质体融合等技术的改造后,其效价已经大幅度的提高,但仍不能满足大规模生产的要求。因此鉴定、分离和克隆武夷菌素产生菌表达产物和调控相关的功能基因,并通过基因改良的方式进行武夷菌素产生菌分子定向育种,来提高武夷菌素的效价及产量变得非常重要。分离鉴定抗生素合成相关基因的传统策略有突变与互补基因分离、表达文库免疫筛选分离、基因组文库筛选及抗性基因连锁标记的分离等,上述几种克隆抗生素合成基因的策略都需要构建大片段基因组文库,如λ噬菌体文库、Cosmid文库、Fosmid文库、YAC文库、BAC文库等。BAC文库与其他几种文库相比具有容量适中、稳定性好、嵌合率低、容易分离等特点。成功构建BAC文库是鉴定、分离和克隆武夷菌素合成相关基因的基础。1.本实验测定了武夷菌素产生菌CK-15菌株的16S rDNA序列并构建系统发育树,分析后得出:CK-15菌株与小白链霉菌(Streptomyces albulus)的16S rDNA相似性高达99.5%,明确武夷菌素产生菌CK-15菌株为小白链霉菌,暂定为小白链霉菌武夷变种(Streptomyces albulus var. wuyiensis)。2.以武夷菌素产生菌CK-15菌株为材料,参照Zhang HB.和Margherita S.等的BAC文库构建方法,并作了一些改进,建立了一套高效的武夷菌素产生菌BAC文库构建技术体系。体系包括高分子量DNA获得、部分酶切最佳条件的确定、片段大小选择的方法、高效的连接转化体系等。3.利用所建立的高效BAC文库构建技术体系,以pCC1BAC为载体,构建了基因组覆盖率6.45倍的小白链霉菌武夷变种CK-15 BAC文库,这是国内外首次构建小白链霉菌武夷变种进行BAC文库。小白链霉菌武夷变种CK-15菌株BAC文库包含462个BAC克隆,随机挑取20个白色克隆进行Not I酶切分析表明文库克降的平均插入大小为121kb,空载率小于1%,文库覆盖率为99.85%。关于BAC文库阳性克隆的筛选及进一步研究还需要在日后的工作中完成。CK-15 BAC文库的构建为开展武夷菌素产生菌重要性状基因的图位克隆、物理作图、基因组测序、功能基因研究等应用提供了重要基因组资源,为使用基因工程手段对武夷菌素产生菌进行分子定向育种奠定了基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章绪论  11-23
  1.1 农用抗生素发展概况  11-14
    1.1.1 农用抗生素的特点  11-12
    1.1.2 农用抗生素的品种  12-13
    1.1.3 农用抗生素——武夷菌素存在的问题  13
    1.1.4 武夷菌素的研究方向  13-14
  1.2 微生物的分类鉴定方法  14-15
    1.2.1 微生物鉴定的依据  14
    1.2.2 微生物鉴定的技术与方法  14
    1.2.3 遗传学分类法  14
    1.2.4 16s rDNA 序列分析  14-15
  1.3 链霉菌基因组研究进展  15-17
  1.4 抗生素生物合成基因簇分离克隆策略  17-18
  1.5 人工染色体文库研究进展  18-20
  1.6 细菌人工染色体的应用  20
  1.7 细菌人工染色体的构建方法  20-21
  1.8 本研究的目的和意义  21-23
第二章材料与方法  23-35
  2.1 实验材料  23-25
    2.1.1 供试材料  23
    2.1.2 大肠杆菌  23
    2.1.3 BAC 载体  23-24
    2.1.4 常用试剂和培养基  24-25
    2.1.5 实验仪器  25
  2.2 试验方法  25-35
    2.2.1 武夷菌素产生菌株 CK-15 的 G+C mol%含量测定  25-26
    2.2.2 武夷菌素产生菌株 CK-15 16s rDNA 序列测定  26
    2.2.3 武夷菌素产生菌株 CK-15 16s rDNA 系统发育分析  26
    2.2.4 高分子量基因组DNA 制备  26-27
    2.2.5 确定最适内切酶  27-28
    2.2.6 确定最适酶切条件  28-29
    2.2.7 高分子量（HMW）DNA 大规模制备  29-30
    2.2.8 酶切片段选择  30
    2.2.9 透析袋的处理  30
    2.2.10 洗脱大片段DNA  30-31
    2.2.11 BAC 载体与大片段 DNA 的连接  31
    2.2.12 连接产物脱盐  31-32
    2.2.13 连接产物的转化  32
    2.2.14 重组克隆的分析  32-33
    2.2.15 BAC 文库稳定性检测  33-35
第三章结果与分析  35-42
  3.1 CK-15 菌株的菌种鉴定  35-37
    3.1.1 CK-15 菌株的 G+C mol%含量测定  35
    3.1.2 CK-15 菌株的165 rDNA 序列测定  35-36
    3.1.3 系统发育分析  36-37
  3.2 构建武夷菌素CK-15 菌株BAC 文库  37-42
    3.2.1 高分子量（HMW）DNA 的制备  37
    3.2.2 确定最适内切酶  37-38
    3.2.3 最适部分酶切条件确定  38-39
    3.2.4 HMW DNA 大规模制备及酶切片段选择  39-40
    3.2.5 CK-15 菌株大片段 DNA 电洗脱回收浓度检测  40
    3.2.6 CK-15 菌株大片段 DNA 的连接与转化  40-41
    3.2.7 CK-15 菌株 BAC 文库插入片段大小检测  41
    3.2.8 CK-15 菌株 BAC 文库稳定性检测  41-42
第四章讨论  42-46
  4.1 CK-15 菌株菌种鉴定  42-43
  4.2 CK-15 菌株 BAC 文库构建  43-46
    4.2.1 高分子量（HMW） DNA 提取  43-44
    4.2.2 高分子量（HMW）DNA 的酶切  44
    4.2.3 高分子量（HMW）DNA 的回收  44
    4.2.4 连接与转化  44-45
    4.2.5 重组克隆的分析  45-46
第五章全文结论  46-47
  5.1 CK-15 菌株菌种鉴定  46
  5.2 CK-15 菌株细菌人工染色体（BAC）文库的构建  46-47
参考文献  47-55
致谢  55-56
作者简历  56

武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体（BAC）文库构建

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