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人和鼠肝微粒体药物代谢检测平台的建立及初步应用研究

作　者: 杨芳
导　师: 陈超
学　校: 西北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人肝微粒体 鼠肝微粒体 细胞色素P450 酶动力学分析 荧光检测技术 高效液相色谱检测技术
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


肝脏是人体重要的生物转化场所,肝细胞的光面内质网（sER）上镶嵌着丰富的代谢酶,负责内源及外源化合物的代谢。这其中包括主要的Ⅰ相药物代谢酶:细胞色素P450（CYP）及黄素单氧化酶（FMO）。破碎肝细胞后,制备人肝脏微粒体（HLM）,其上保留着这些酶。因此HLM可以用来进行体外的药物代谢研究,包括ⅰ).CYP反应表型研究;ⅱ).基于CYP的药物相互作用研究,以及代谢稳定性的研究。药物代谢的体外和体内研究数据有一定的相关性,体外研究有助于解释临床数据,可用于评价药物在人体内潜在的代谢情况。采用体外研究早期发现人体内药物代谢的途径和产物,可以为临床前研究提供明确的方向。本研究的目的是建立体外药物代谢研究用的人和鼠肝微粒体药物代谢模型,并对其应用进行初探。首先用改良后的Omura法,制备SD大鼠和混合人肝微粒体。制备好的人、鼠肝微粒体经一氧化碳还原示差法对P450酶含量进行测定。之后用荧光检测技术检测肝微粒体对荧光底物CEC、DBF、AMMC和EFC的代谢情况,初步判断肝微粒是否具有P450酶催化活性。定量结果显示制备的人、鼠肝微粒体在450nm有明显的吸收峰,测得P450酶含量分别为593±27pmol/mg和964.67±32pmol/mg。通过与四种荧光底物进行多次酶活性检测。除了EFC底物无明显催化活性,人肝微粒体对AMMC的催化活性较弱外,人肝和鼠肝微粒体均可以与CEC、DBF底物作用,呈现出明显而稳定的催化活性,在一定范围内荧光信号随着酶浓度增大而增大,随着时间的延长而增强。其次用高效液相色谱技术进一步评价肝微粒体药物代谢检测平台的可靠性,将肝微粒体与特异性探针底物bufuralol、coumarin、s-mephenytoin和nifedipine反应,分析生成的产物,计算Km、Vmax值,根据CLint=Vmax/Km计算内在清除率。同时用2D6、2A6、2C19和3A4特异性抑制剂奎宁丁、反苯环丙胺及酮康唑对人、鼠肝微粒体进行抑制实验,察看抑制效应强弱,求解IC50值。结果显示:鼠肝微粒体对探针底物bufuralol和nifedipine有显著的催化活性,而对coumarin和s-mephenytoin无代谢;人肝微粒体则对四种特异性探针底物均有明显而稳定的催化活性,所求得的Km、Vmax和CLint值也与文献报道的相符。特异性抑制剂对鼠肝微粒体均无抑制效应,而对人肝微粒体则显示出了较强的抑制效应,IC50值较小。通过多方面的比较,证明了本研究建立的人、鼠肝微粒体体外药物代谢平台的可行性和可靠性。荧光检测和高效液相色谱检测结果表现出一致性。活性测定结果和抑制作用检测结果表明了人、鼠肝微粒体可用于CYP450酶及其相关药物代谢研究的体外模型,使实验结果相互验证。在人肝微粒体与重组人细胞色素P450酶比较中,证明了采用酶反应活性测定及其选择性抑制作用测定的结合模式具有科学性。总之本研究成功建立了人、鼠肝微粒体药物代谢检测平台,并对其应用进行了初探。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-11
英文缩略语表  11-12
前言  12-14
第一章 文献回顾  14-29
  1 药物代谢的研究进展  14-19
    1.1 药物代谢的过程及研究进展  14-15
    1.2 药物代谢的场所  15
    1.3 药物代谢酶系统  15-16
    1.4 影响药物代谢的因素  16-19
      1.4.1 种属差异  16-17
      1.4.2 个体差异  17-18
      1.4.3 药物相互作用  18-19
  2 人肝细胞色素P450及其在药物代谢中作用的研究进展  19-27
    2.1 CYP450的命名与分布  19-20
    2.2 CYP450在药物代谢中的作用及其功能成份  20-21
    2.3 CYP450酶的遗传多态性  21-22
    2.4 与CYP450有关的体外药物代谢研究方法进展  22-25
      2.4.1 肝微粒体体外代谢法  22-23
        2.4.1.1 肝微粒体的用途  22-23
        2.4.1.2 肝微粒的模型特点  23
      2.4.2 肝细胞体外代谢法  23-24
      2.4.3 肝切片法  24
      2.4.4 离体肝灌流法  24
      2.4.5 重组CYP450酶  24-25
    2.5 与CYP450有关的药物代谢检测方法进展  25-26
      2.5.1 色谱检测技术  25-26
      2.5.2 放射性检测技术  26
      2.5.3 荧光检测技术  26
      2.5.4 生物发光检测技术  26
    2.6 CYP450药物代谢系统的评价方法  26-27
      2.6.1 代谢稳定性评价方法  26-27
      2.6.2 CYP450酶抑制的评价方法  27
      2.6.3 CYP450酶诱导的评价方法  27
  3 CYP450药物代谢研究的展望  27-29
第二章 大鼠和人肝微粒体药物代谢检测平台的建立及初步评价  29-41
  1 材料  29-31
    1.1 肝组织材料  29
      1.1.1 大鼠肝组织材料  29
      1.1.2 人肝组织材料  29
    1.2 试剂  29-30
    1.3 主要溶液  30
    1.4 主要仪器  30-31
  2 方法  31-33
    2.1 鼠肝微粒体的制备及鉴定  31-32
      2.1.1 样品的处理  31
      2.1.2 肝微粒体的制备  31
      2.1.3 肝微粒体浓度的测定  31
      2.1.4 肝微粒体中P450含量的测定  31-32
      2.1.5 肝微粒体制备条件的优化  32
      2.1.6 荧光检测技术测定大鼠肝微粒体中P450酶活性  32
    2.2 人肝微粒体的制备及鉴定  32-33
      2.2.1 肝脏的采集  32-33
      2.2.2 样品的处理  33
      2.2.3 肝微粒体的制备  33
      2.2.4 肝微粒体浓度的测定  33
      2.2.5 肝微粒体中P450含量的测定  33
      2.2.6 荧光检测技术测定人肝微粒体中P450酶活性  33
  3 结果  33-37
    3.1 大鼠肝微粒的制备及测定结果  33-36
      3.1.1 BSA标准曲线绘制  33-34
      3.1.2 鼠肝微粒体中P450含量的测定  34-35
      3.1.3 荧光检测技术测定鼠肝微粒体中P450酶活性  35-36
    3.2 人肝微粒的制备及测定结果  36-37
      3.2.1 BSA标准曲线绘制  36
      3.2.2 人肝微粒体中P450含量的测定  36-37
      3.2.3 荧光检测技术测定鼠肝微粒体中P450酶活性  37
  4 讨论  37-41
    4.1 肝微粒体模型的建立  38-39
    4.2 肝微粒体模型的初步评价  39-41
      4.2.1 P450酶含量的测定  39-40
      4.2.2 P450活性的初步检测  40-41
第三章 HPLC检测技术鉴定人、鼠肝微粒体药物代谢检测平台及其应用研究的初探  41-58
  1 材料  41-42
    1.1 肝微粒体  41
    1.2 主要试剂  41-42
    1.3 主要溶液  42
    1.4 主要仪器  42
  2 方法  42-49
    2.1 高效液相色谱技术测定大鼠肝微粒体中P450酶活性  42-46
      2.1.1 用Bufuralol(2D6底物)测定鼠肝微粒体中2D6酶活性  42-44
      2.1.2 用Coumarin(2A6底物)测定鼠肝微粒体中2A6酶活性  44-45
      2.1.3 用S-Mephenytoin(2C19底物)测定鼠肝微粒体中2C19酶活性  45
      2.1.4 用Nifedipine(3A4底物)测定鼠肝微粒体中3A4酶活性  45-46
    2.2.高效液相色谱技术测定人肝微粒体中P450酶活性  46-49
      2.2.1 用Bufuralol(2D6底物)测定人肝微粒体中2D6酶活性  46-47
      2.2.2 用Coumarin(2A6底物)测定人肝微粒体中2A6酶活性  47-48
      2.2.3 用S-Mephenytoin(2C19底物)测定人肝微粒体中2C19酶活性  48-49
      2.2.4 用Nifedipine(3A4底物)测定人肝微粒体中3A4酶活性  49
  3 结果  49-54
    3.1 各探针底物标准曲线的建立  49-50
    3.2 鼠肝微粒体与各底物反应时间和酶浓度的优化  50
    3.3 人肝微粒体与各底物反应时间和酶浓度的优化  50-51
    3.4 鼠肝微粒体与各底物反应酶动力学参数的计算  51
    3.5 人肝微粒体与各底物反应酶动力学参数的计算  51-52
    3.6 各特异性抑制剂对鼠肝微粒体的抑制及IC_(50)  52-53
    3.7 各特异性抑制剂对人肝微粒体的抑制及IC_(50)  53-54
  4 讨论  54-58
    4.1 HPLC与荧光检测方法的比较  54
      4.1.1 色谱检测技术与荧光检测技术的比较  54
      4.1.2 色谱检测与荧光检测结果的比较  54
    4.2 HLM和RLM药物代谢模型的比较  54-56
      4.2.1 酶动力学参数的比较  55
      4.2.2 抑制效应(IC_(50))的比较  55-56
    4.3 HLM和重组P450酶药物代谢模型的比较  56-57
      4.3.1 酶动力学参数的比较  56-57
      4.3.2 抑制效应(IC_(50))的比较  57
    4.4 实验数据与报道文献的比较  57
    4.5 小结  57-58
全文小结  58-60
  1 结论  58-59
  2 今后工作展望  59-60
附录  60-67
参考文献  67-76
致谢  76

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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