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钴螯合亲和介质的制备及其在六聚组氨酸融合蛋白纯化中的应用

作　者: 杨柳
导　师: 崔亚丽
学　校: 西北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 六聚组氨酸融合蛋白 固定化金属螯合亲和层析 钴离子 磁性复合微粒 纯化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


金属螯合亲和层析（Metal Chelate Affinity Chromatographic,MCAC）,又称固定金属离子亲和层析（Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography,IMAC）,是一种选择性好、操作简单的蛋白质分离方法。共价固定于高分子微球表面的配基与Ni2+,Co2+等过渡金属离子形成配位数未饱和的螯合物,基因工程表达的六聚组氨酸融合蛋白可通过其组氨酸标签与螯合物通过配位作用结合,因此,金属离子螯合物已被广泛用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化。螯合有Ni2+,Ci2+的磁性复合微粒也成为新的研究热点。本研究以琼脂糖微球（AgaroseCL-6B）和二氧化硅磁性微球为载体,分别合成了表面载有钴离子-羧甲基天冬氨酸螯合物的金属螯合亲和介质,并将其用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究,具体内容如下:1.以Sepharose CL-6B为载体,环氧氯丙烷为活化剂,羧甲基天冬氨酸为螯合配基制备载有Co2+的金属螯合亲和层析介质Agarose-CM-Asp-Co,建立了变性和非变性条件下对六聚组氨酸融合蛋白较大规模的纯化体系。将该纯化介质与镍螯合羧甲基天冬氨酸琼脂糖微球（Agarose-CM-Asp-Ni）,商品化（Qiagen公司）镍螯合次氨基三乙酸琼脂糖微球（Ni-NTA-Agarose）的性能进行了比较研究。以Bradford法对蛋白质的最大纯化量进行测定,以SDS-PAGE对纯化得到目的蛋白的纯度进行鉴定。结果表明,Agarose-CM-Asp-Co亲和层析介质在非变性条件下对六聚组氨酸融合蛋白DXS的最佳孵育时间为15min,最大纯化量约为14.8mg/mL。在变性条件下对六聚组氨酸融合蛋白CD155D1的最佳孵育时间为20min,最大纯化量约为7.6mg/mL。与螯合镍的配合物相比,该纯化介质具有结合容量大,选择性高等优点。2.以二氧化硅磁性微粒为载体,羧甲基天冬氨酸为配基制备螯合有Co2+的磁性复合微粒Affimag-CM-Asp-Co,并将其用于小规模六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究。优化了500μL细胞裂解液中六聚组氨酸融合蛋白纯化所需磁粒用量,Affimag-CM-Asp-Co与细胞裂解液的孵育时间,纯化缓冲液体系等条件。结果表明:对500μL细胞裂解液纯化体系,Affimag-CM-Asp-Co的优选用量为1mg,最佳孵育时间为10min。以Bradford法对蛋白质进行测定,Affimag-CM-Asp-Co在非变性条件下对六聚组氨酸融合蛋白DXS的纯化量为9.4μg/mg。与柱层析法相比,基于Affimag-CM-Asp-Co的六聚组氨酸融合蛋白纯化方法操作简便,耗时短,得到的目的蛋白纯度高。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章 文献综述  9-28
  1 金属螯合亲和层析技术  9-10
  2 金属螯合亲和层析作用原理  10-12
  3 金属螯合亲和层析介质的组成  12-20
    3.1 固相载体  12-18
    3.2 配基  18-20
    3.3 金属离子  20
  4 影响蛋白质在IMAC介质上吸附与解吸的因素  20-23
    4.1 蛋白质表面配体的影响  20-21
    4.2 溶液pH的影响  21-22
    4.3 离子强度的影响  22
    4.4 竞争洗脱剂的影响  22-23
  5 金属螯合亲和层析技术的应用  23-27
    5.1 金属螯合亲和层析用于生物分离纯化  23-24
    5.2 金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性  24-25
    5.3 金属螯合亲和层析用于蛋白质的识别和鉴定  25-26
    5.4 金属螯合亲和层析技术在其它领域的应用  26-27
  论文的出发点和主要工作  27-28
第二章 钴螯合亲和介质的制备  28-35
  1 实验材料  28
    1.1 试剂  28
    1.2 仪器  28
  2 试验方法  28-31
    2.1 金属螯合琼脂糖微球的制备  28-30
    2.2 金属螯合磁性微粒的制备  30-31
  3 结果与讨论  31-34
    3.1 金属螯合琼脂糖微球电子扫描显微镜表征  31-32
    3.2 金属螯合亲和层析介质红外表征  32-33
    3.3 Agarose-CM-Asp-Co、Agarose-CM-Asp-Ni微球上螯合金属离子量的原子吸收分光  光度法测定  33
    3.4 钴螯合磁性微粒Affimag-CM-Asp-Co的透射电镜表征  33
    3.5 钴螯合磁性微粒Affimag-CM-Asp-Co的磁滞回曲线  33-34
  本章小结  34-35
第三章 钴螯合琼脂糖微球用于融合蛋白纯化  35-44
  1 实验材料  35-36
    1.1 试剂与样品  35
    1.2 菌种与质粒  35
    1.3 培养基与缓冲液  35-36
    1.4 仪器  36
  2 实验方法  36-38
    2.1 六聚组氨酸融合蛋白的诱导表达及细胞裂解液的制备  36-37
    2.2 金属螯合亲和层析  37
    2.3 Agarose-CM-Asp-Co, Agarose-CM-Asp-Ni与Ni-NTA树脂(Qiagen)比较  37-38
  3 实验结果及讨论  38-43
    3.1 融合蛋白吸附动力学曲线  38-39
    3.2 螯合树脂最大纯化量  39
    3.3 缓冲液体系的选择  39-40
    3.4 金属螯合亲和层析  40-41
    3.5 Agarose-CM-Asp-Co, Agarose-CM-Asp-Ni与Ni-NTA与Ni-TA树脂(Qiagen)比较  41-43
  本章小结  43-44
第四章 钴螯合二氧化硅磁性微粒用于融合蛋白纯化  44-51
  1 材料  44-45
    1.1 试剂与样品  44
    1.2 菌种与质粒  44
    1.3 培养基与缓冲液  44-45
    1.4 仪器  45
  2 实验方法  45-47
    2.1 六聚组氨酸融合蛋白的诱导表达及细胞裂解液的制备  45
    2.2 纯化条件的优化  45-47
  3 结果和讨论  47-49
    3.1 磁粒用量的确定  47
    3.2 孵育时间的确定  47-48
    3.3 缓冲液体系的选择  48
    3.4 阴性对照试验  48-49
    3.5 Affimag-CM-Asp-Co纯化容量  49
  本章小结  49-51
全文总结  51-52
参考文献  52-61
致谢  61

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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