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钝顶节旋藻高浓度NH_4HCO_3耐受株诱变选育及二氧化碳浓缩机制相关基因表达分析

作　者: 张兴魁
导　师: 茅云翔
学　校: 中国海洋大学
专　业: 遗传学
关键词: 钝顶节旋藻 紫外线 甲基磺酸乙酯 亚硝基胍 诱变 碳酸氢铵 二氧化碳浓缩机制 实时荧光定量PCR
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


节旋藻（Arthrospira）被世界粮农组织誉为21世纪人类最理想的食品,上世纪80年代已经实现工业化养殖。进一步改良藻种种质,获得在工业生产上具有优良性状的突变株,并深入了解与节旋藻光合作用密切相关的二氧化碳浓缩机制对于节旋藻养殖有着重要的意义。节旋藻正常生长需要氮源和碳源,而适宜浓度的NH4HCO3可以同时为藻体提供氮源和碳源。而且利用氨水吸收工业废气中的CO2是新的发展趋势,有效的利用NH4HCO3对于节能减排有重要意义。高浓度的NH4+还可以在节旋藻大规模养殖中对于原生动物有杀灭作用。但是高浓度的NH4+对于正常生长的藻体也会有伤害,因此有必要筛选能够在高浓度NH4HCO3下可以生长的钝顶节旋藻。节旋藻的二氧化碳浓缩机制（CCM）在固碳过程中起着重要的作用。羧酶体是CCM机制的主要元件,ccmM及ccmO编码了羧酶体包被蛋白相关基因;且CCM机制的关键酶之一-碳酸酐酶现在还未有报道,而ccmM基因编码的蛋白其N-末端结构域与γ-碳酸酐酶相似。因此本论文还试图通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）手段了解ccmM及ccmO基因的表达特性,以了解钝顶节旋藻CCM机制的表达情况。本论文首先比较了紫外线、EMS、NTG三种不同诱变剂对于钝顶节旋藻的诱变效果,选择了NTG作为最适宜的诱变剂诱导钝顶节旋藻发生突变。在0.022mol/lNH4HCO3的选择压下,筛选得到了8株能够耐受高浓度NH4HCO3突变株。并比较了诱变前后藻株在高浓度NH4HCO3条件下的生长速率及光合速率。结果表明,0.004mol/l的NH4HCO3最有利于出发藻株的生长,在NH4HCO3浓度为0.022mol/l时达到出发株的耐受极限。在8株突变株中有5株突变株对于NH4HCO3的耐受性与出发藻株有显著性差异。比较0.022mol/l NH4HCO3下各突变株的比生长速率,可以知道2号突变株在0.004mol/l NH4+浓度时,比生长速率较出发藻株提高了29.3%,5、6、8号突变株在400mg/l NH4+浓度时,比生长速率为正值,而同样处理条件下出发株的比生长速率为负值。说明在此浓度的选择压下,突变株可以存活而出发株不能存活。比较0.022mol/l NH4HCO3下各突变株的光合速率,发现2号突变株的最大净光合速率在0.004mol/l NH4+浓度时出现,为3.066×10-4nmol·h-1·cell-1,比出发藻株提高了14.8%,在160mg/lNH4+浓度时2号突变株的净光合速率比出发藻株提高了93.7%。4、5、6、8号突变株的最大净光合速率都在0.008mol/l NH4+浓度时出现,分别为2.883×10-4nmol·h-1·cell-1、3.027×10-4nmol·h-1·cell-1、2.969×10-4nmol·h-1·cell-1、3.310×10-4nmol·h-1·cell-1,比出发藻株分别提高了91.4%、101.00%、97.1%和119.79%。用生长曲线检验发现这5株突变株有着优良的遗传稳定性。另一方面,本论文还用2% CO2通气培养钝顶节旋藻48hrs抑制CCM相关的诱导型基因的表达,再通入含有低浓度CO2的空气以诱导CCM相关的诱导型基因的表达。通过测定低碳诱导后钝顶节旋藻光合效率变化情况确定CCM机制的作用情况;通过RT-PCR手段,研究低碳诱导后钝顶节旋藻CCM机制相关的ccmM、ccmO基因的表达情况。结果表明,钝顶节旋藻经低碳诱导后,光合效率有所降低,并在低碳诱导30min后光合效率达到稳定,说明低碳诱导30min后CCM机制就已经稳定发挥作用;通过RT-PCR手段,我们发现经过低碳诱导以后,ccmM、ccmO基因的表达没有显著性变化,说明钝顶节旋藻CCM机制在经过短时间的低碳诱导以后,羧酶体的数目没有显著变化,且ccmM基因编码的蛋白在藻体内可能并不能起到碳酸酐酶的作用,在钝顶节旋藻藻体内可能还有另外的未发现的碳酸酐酶存在。综上所述,本论文证明通过诱变剂诱发节旋藻的基因突变,并加以适当的选择,这在选育节旋藻优良品种方面是可以大有作为的;并证明了钝顶节旋藻在经过短时间的低碳诱导以后,羧酶体的数目没有显著变化,且ccmM基因编码的蛋白在藻体内并不能起到碳酸酐酶的作用。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-12
第一部分 钝顶节旋藻高浓度NH_4HCO_3 耐受株诱变选育  12-52
  0 前言  12-21
    0.1 微藻诱变育种技术进展  12-15
      0.1.1 微藻利用价值  12
      0.1.2 微藻诱变技术  12-13
      0.1.3 微藻诱变育种进展  13-15
    0.2 节旋藻诱变育种技术进展  15-18
      0.2.1 节旋藻概述  15-16
      0.2.2 节旋藻的利用价值  16-17
      0.2.3 节旋藻的诱变进展  17-18
    0.3 节旋藻耐高铵品系选育与应用  18-21
  1 材料与方法  21-27
    1.1 实验材料  21
    1.2 主要仪器  21-22
    1.3 试剂及其配制  22-23
      1.3.1 PBS 缓冲液配制  22
      1.3.2 pH6.0 的磷酸缓冲液  22
      1.3.3 pH7.2 的磷酸缓冲液  22
      1.3.4 EMS 母液配制  22-23
      1.3.5 NTG 母液配制  23
    1.4 实验方法  23-27
      1.4.1 正常藻株生长情况测定方法  23
      1.4.2 钝顶节旋藻光合生理特性测定方法  23
      1.4.3 钝顶节旋藻高浓度碳酸氢铵耐受能力实验  23-24
      1.4.4 紫外线诱变钝顶节旋藻流程  24
      1.4.5 EMS 诱变钝顶节旋藻流程  24-25
      1.4.6 NTG 诱变钝顶节旋藻流程  25
      1.4.7 耐高碳酸氢铵突变株的筛选  25-26
      1.4.8 耐高碳酸氢铵突变株遗传稳定性研究方法  26
      1.4.9 突变藻株对碳酸氢铵耐受性研究及光合生理特性研究  26-27
  2 研究结果  27-48
    2.1 节旋藻出发株生理特性  27-32
      2.1.1 钝顶节旋藻OD 值与细胞密度关系  27-28
      2.1.2 钝顶节旋藻出发藻株在正常培养条件下的生长情况  28-29
      2.1.3 钝顶节旋藻出发藻株光饱和点测定情况  29-30
      2.1.4 钝顶节旋藻出发藻株碳酸氢铵浓度耐受范围  30-32
    2.2 三种方法诱变钝顶节旋藻藻株的比较  32-40
      2.2.1 紫外线诱变钝顶节旋藻藻株  32-34
      2.2.2 EMS 诱变钝顶节旋藻藻株  34-36
      2.2.3 NTG 诱变钝顶节旋藻藻株  36-38
      2.2.4 三种诱变方法对钝顶节旋藻诱变效果比较  38-40
    2.3 钝顶节旋藻突变藻株生长特性  40-48
      2.3.1 NTG 诱变钝顶节旋藻耐高碳酸氢铵突变株的筛选  40-42
      2.3.2 NTG 诱变钝顶节旋藻高碳酸氢铵耐受突变株的净光合速率研究  42-43
      2.3.3 耐高碳酸氢铵突变株遗传稳定性研究  43-48
  3 讨论  48-52
    3.1 不同诱变剂诱变效应存在差异的原因  48-49
    3.2 遗传突变与环境适应  49
    3.3 节旋藻具有较强抗诱变能力的原因  49-50
    3.4 随机诱变与定向选育  50-52
第二部分 节旋藻二氧化碳浓缩机制相关基因表达特性分析  52-73
  0 前言  52-59
    0.1 CO_2 浓缩机制(CO_2 Concentrating Mechanism, CCM)研究进展  52-55
      0.1.1 蓝藻CCM 机制的运行机制  52-53
      0.1.2 蓝藻CCM 机制的组成  53-55
    0.2 节旋藻CCM 研究进展  55-56
    0.3 钝顶节旋藻CCM 相关基因  56-59
  1 材料与方法  59-65
    1.1 材料  59
    1.2 试剂  59-60
    1.3 主要仪器  60
    1.4 实验方法  60-65
      1.4.1 引物设计  60-61
      1.4.2 藻株处理方法  61
      1.4.3 钝顶节选藻总RNA 提取  61-62
      1.4.4 钝顶节选藻总RNA 纯化  62
      1.4.5 cDNA 制备  62
      1.4.6 实时荧光定量PCR（RT-PCR）反应体系及反应条件  62-63
      1.4.7 RT-PCR 数据分析方法-相对定量：  63-65
  2 研究结果  65-70
    2.1 钝顶节旋藻低碳条件下光合强度分析  65
    2.2 RNA 制备  65-66
    2.3 CCM 相关基因表达分析  66-70
      2.3.1 内参基因和目标基因扩增效率检测  66-67
      2.3.2 低碳处理不同时间ccmM 基因表达分析  67-68
      2.3.3 低碳处理不同时间ccmO 基因表达分析  68-70
  3 讨论  70-73
    3.1 钝顶节旋藻在低浓度Ci 诱导下生理情况的变化  70
    3.2 钝顶节旋藻藻体内碳酸酐酶的分析  70-71
    3.3 钝顶节旋藻二氧化碳浓缩机制的特殊性  71-73
参考文献  73-84
致谢  84

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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