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牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及在进境牛检疫中的应用

作　者: 周斌华
导　师: 吴艳涛；孔繁德
学　校: 扬州大学
专　业: 兽医
关键词: 牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV) ELISA 中和试验 PCR 测序病毒分离
分类号: S851.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

我国广东、广西、河南、河北、上海、山东、四川、甘肃、新疆、黑龙江和青海等地的黑白化奶牛、本地黄牛、水牛或牦牛均有IBR存在。该病广泛分布于世界各地，迄今只有奥地利、丹麦、芬兰、瑞士和瑞典消灭了该病，一些国家已启动了控制程序。该病的典型症状主要出现在上呼吸道，如化脓性鼻液伴有结膜炎，一般症状有发烧、抑郁、厌食、流产和奶产量下降。病毒感染生殖道导致外阴道炎和龟头皮炎。该病虽死亡率较低，许多感染牛呈亚临床症状经过，但常处于潜伏感染和长期排毒，在运输、拥挤等应急条件下常导致发病及继发感染，由于其流行范围广，对牛产奶量、繁殖力和役牛的使役能力均有较大影响，并严重影响国际牛业贸易。清除抗体阳性牛，排除潜伏感染动物是控制IBR的最简单也是最好的方法。奥地利、丹麦、芬兰、瑞士和瑞典等国由于采取捕杀抗体阳性牛，已将本病消灭。此捕杀措施是基于抗体阳性牛为病毒的携带者这一事实，所以关键问题是要建立一种足够敏感的方法检出IBR阳性牛。对IBR疾病的监测与诊断，国际上已普遍使用ELISA和病毒中和试验进行BHV1抗体检测，或从鼻拭子和其它脏器分离病毒并进行病原鉴定。到目前为止，PCR主要应用于精液病毒检测，而实验证明PCR能够快速灵敏的检测牛的IBRV，特别是对IBRV的潜伏感染的诊断，在IBR的诊断特别是在牛业国际贸易中具有广阔的应用前景。对进口牛的检疫，我国目前的检测方法是：在隔离检疫期间，主要应用ELISA或SN检测血清样品中BHV1抗体，采取BHV1抗体阳性牛鼻拭子样品，接种MDBK细胞，再用SN鉴定培养物中引起CPE的病毒，由于SN对技术要求较高，所需时间长，本文改用PCR鉴定病毒，简便快速。本研究根据BHV1的gB基因序列设计一对引物，对IBRV进行PCR检测，并对反应条件进行优化，应用于进口牛检疫，结果，最佳反应条件为：变性温度为95℃，退火温度为64℃，72℃延伸，循环次数为35个循环，Mg²⁺的最佳浓度为1.6mM，dNTP_S的最佳反应浓度为0.36mM，引物的最佳浓度为0.2pmol／uL，Taq酶的最佳浓度0.4U／50uL。用这对引物扩增IBRV、HCV、PRRSV、PRV，只有IBRV扩增出期望的362bp的特异性条带，具有特异性。该PCR方法的检测敏感度为1.2ng／50uL，说明其具有很好的敏感性。在对3000多头进口奶牛实施隔离检疫期间，采取其血清进行牛传染性鼻气管炎病毒抗体的ELISA检测，结果血清IBR抗体阳性数量达到1293头，阳性率高达42％。采集阳性牛鼻拭子用MDBK细胞进行病毒分离，应用以上所建立的PCR反应体系对病毒分离物进行检测，从5份分离物中扩增出与预计大小（362bp）相吻合的基因片段，测序结果表明该序列与IBR标准毒株的序列完全一致。这些病毒分离株用BHV1阳性血清进行病毒中和试验，病毒能被阳性血清中和，MDBK细胞不出现CPE，而用阴性血清则出现典型的细胞病变，即细胞变圆、卷缩成葡萄串样等。同时将分离毒作负染电镜观察，可见病毒粒子呈球形，含囊膜，直径约175～200nm。PCR检测结果与SN、序列分析及电镜观察结果相符，结果表明将PCR应用于进口牛检疫是切实可行的。

全文目录

中文摘要  2-4
英文摘要  4-9
1 综述  9-22
  1.1 IBRV的分类地位和抗原性  9-10
  1.2 IBR的诊断  10-14
  1.3 IBR流行情况  14-16
  1.4 IBR的检疫和防控  16-22
2 牛传染性鼻气管炎 PCR检测方法的建立牛传染性鼻气管炎 PCR检测方法的建立  22-30
  引言  22-23
  2.1 材料与方法  23-26
  2.2 结果  26-28
  2.3 讨论  28-30
3 牛传染性鼻气管炎 PCR检测方法在进境牛检疫中的应用  30-36
  3.1 材料与方法  30-33
  3.2 结果  33-35
  3.3 讨论  35-36
参考文献  36-43
致谢  43

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及在进境牛检疫中的应用

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