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长角血蜱生物学特性研究及免疫原基因的筛选

作　者: 李知新
导　师: 孙晓林；刘光远
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 长角血蜱生物学特性 cDNA表达文库免疫筛选
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

长角血蜱是我国流行最广泛的蜱种之一,主要叮咬牛、羊以及多种脊椎动物,是病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌、原虫、支原体、以及衣原体等多种重要病原的传播媒介,主要影响家畜的生产性能,为畜牧业的发展造成极为严重的危害,具有重要的流行病学意义。本研究旨在实验室条件调查我国北方长角血蜱甘肃株的生物学特性,在此基础上构建卵的cDNA文库,利用免疫学方法筛选克隆免疫原基因。获得以下结果:1、长角血蜱为三宿主型,完成一个世代需101~148d;成年饥饿雌蜱吸血期具有两个显著特征:缓慢和快速吸血;不同饲喂条件下长角血蜱饱血体重、产卵量差异极显著(P<0.01),饱血体重越大,产卵量越大;经兔体叮咬的成年雌蜱其饱血体重小于羊体。在一定温度范围内,幼蜱、若蜱的蜕皮时间随温度升高而缩短;当饱血雌蜱处于发育阶段时,产卵前期、产卵期及卵的孵化期都随着温度的升高而缩短;16℃~30℃条件下长角血蜱产卵量没有变化,利于蜱存活;4℃以下和45℃以上饱血蜱及其后代不能存活,而饥饿蜱可以存活;16℃以下蜱的发育周期延长。随着湿度增加产卵量增加,70%相对湿度以下发育周期均延长。结果表明,雄蜱可以帮助雌蜱吸血,蜱自身因素和外界因素对长角血蜱的发育繁殖有影响。2、孤雌生殖的长角血蜱也为三宿主型;在兔体完成一个世代共需106~154d,饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重差异不显著(P>0.05),而饱血体重与两性生殖的长角血蜱种群饱血体重差异极显著(P<0.01);雌蜱饱血体重可达吸血前的108.46±19.72倍,与两性生殖的种群饱血体重差异亦极显著(P<0.01)。雌蜱产卵量与饱食体重之间呈极显著的正相关r=0.8970(P<0.01);生殖效率指数REI=6.76,生殖适合度指数RFI=6.29;蜱发育时间在不同季节无明显变化。3、利用单、双向琼脂糖凝胶扩散试验检测各长角血蜱饥饿雄蜱蛋白阳性血清的滴度,结果表明,用成年长角血蜱雄蜱蛋白在家兔淋巴内外注射制备的两种抗血清,其抗体效价分别达1:128、1:64,可判定为阳性血清;检测直接用雄蜱叮咬兔子制备的血清抗体效价为1:8。雄性成蜱抗原与卵、幼蜱、若蜱抗原免疫动物制备的血清之间存在交叉免疫。淋巴内免疫制备的血清更适合于长角血蜱cDNA表达文库的免疫学筛选。4、所构建的长角血蜱卵的cDNA文库的库容量约为4.0×106pfu,重组率为99%,扩增后文库的滴度为9.07×1010pfu/ml。对文库用已知的促卵泡激素引物进行扩增,得到长角血蜱促卵泡激素全长cDNA序列。与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素(DQ248886)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为97.8%和99%。说明所构建的长角血蜱卵cDNA表达文库库容量大、重组率高,为筛选功能基因奠定了基础。5、免疫筛选获得12个阳性克隆。经Genbank blast序列比对确证后,认为3个为长角血蜱免疫原基因,还有4个基因分别是热休克蛋白、rRNA串联重复序列、组胺激酶和假定蛋白,其余克隆与Genbank数据库中的序列无明显的同源性,有待进一步研究。

全文目录

摘要  2-4
英文摘要  4-10
第一部分蜱结合蛋白的研究进展  10-25
  1 蜱类概述  10-12
  2 蜱结合蛋白的研究进展  12-25
    2.1 免疫球蛋白结合蛋白  12-15
      2.1.1 免疫球蛋白结合蛋白的发现  12-13
      2.1.2 免疫球蛋白结合蛋白在宿主体内的代谢、分布及特点  13-15
      2.1.3 免疫球蛋白结合蛋白的生物化学性质  15
      2.1.4 免疫球蛋白结合蛋白的应用前景  15
    2.2 组胺结合蛋白  15-17
      2.2.1 组胺结合蛋白的发现  16
      2.2.2 组胺结合蛋白的结构特征  16-17
      2.2.3 组胺结合蛋白的应用前景  17
    2.3 IL-2 结合蛋白  17-19
      2.3.1 IL-2 与 IL-2 结合蛋白的关系  17-18
      2.3.2 IL-2 结合蛋白与蜱传播的病原的关系  18-19
      2.3.3 IL-2 结合蛋白的应用前景  19
    2.4 蜱结合蛋白的应用及展望  19-25
第二部分试验研究  25-76
  第一章不同饲喂条件下长角血蜱生物学特性研究  25-36
    1.1 材料  25
      1.1.1 长角血蜱和实验动物  25
      1.1.2 主要仪器和设备  25
    1.2 实验方法  25-27
      1.2.1 蜱在动物体的饲喂方式  26
      1.2.2 不同温度与湿度下对长角血蜱的影响  26-27
    1.3 结果  27-31
      1.3.1 不同饲喂方式对长角血蜱的影响  27-28
      1.3.2 湿度与长角血蜱的发育  28-30
      1.3.3 温度与长角血蜱的发育  30-31
    1.4 讨论  31-36
      1.4.1 蜱自身因素的影响  31-33
      1.4.2 外界环境因素的影响  33-36
  第二章实验条件下长角血蜱行孤雌生殖的生物学特性研究  36-41
    2.1 材料与方法  36-37
      2.1.1 材料  36
      2.1.2 实验方法  36-37
    2.2 结果  37-39
      2.2.1 孤雌生殖株的发育周期  37
      2.2.2 孤雌生殖株吸血前后体重的变化  37-38
      2.2.3 孤雌生殖株产卵的特点  38-39
      2.2.4 孤雌生殖现象的观察  39
    2.3 讨论  39-41
  第三章兔抗长角血蜱饥饿雄蜱蛋白阳性血清的制备及鉴定  41-47
    3.1 材料与方法  41-44
      3.1.1 材料  41-42
      3.1.2 方法  42-43
      3.1.3 血清效价的检测  43-44
    3.2 结果  44
      3.2.1 蛋白含量的测定  44
      3.2.2 阳性血清的检测  44
    3.3 讨论  44-47
  第四章长角血蜱卵cDNA 表达文库的构建  47-66
    4.1 材料与方法  47-56
      4.1.1 实验材料  47-48
      4.1.2 实验方法  48-56
    4.2 cDNA 文库的质量检测  56-59
      4.2.1 引物的设计与合成  56
      4.2.2 从cDNA 文库中的 PCR 扩增  56
      4.2.3 目的基因扩增片段的纯化和回收  56-57
      4.2.4 目的片段的克隆  57-59
    4.3 结果  59-62
      4.3.1 RNA 和mRNA 检测结果  59-60
      4.3.2 双链cDNA 检测结果  60
      4.3.3 大片段cDNA 的选择  60
      4.3.4 cDNA 文库基础库容量  60-61
      4.3.5 扩增文库库容量  61
      4.3.6 目的基因的克隆、鉴定和序列分析  61-62
    4.4 讨论  62-66
  第五章长角血蜱卵cDNA 表达文库的免疫学筛选  66-76
    5.1 材料与方法  66-71
      5.1.1 材料  66-67
      5.1.2 方法  67-71
    5.2 结果  71-73
      5.2.1 阳性克隆的筛选结果  71
      5.2.2 阳性克隆的鉴定  71-73
    5.3 讨论  73-76
结论  76-77
致谢  77-78
参考文献（实验部分）  78-82
作者简介  82-83
导师简介  83-84
附录  84-85

长角血蜱生物学特性研究及免疫原基因的筛选

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