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川东獐牙菜（口山）酮的研究

作　者: 张有理
导　师: 郑一敏
学　校: 重庆大学
专　业: 药物化学
关键词: 川东獐牙菜 去甲基雏菊叶龙胆酮 指纹图谱 代谢动力学 GLP-1
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


川东獐牙菜(Swertia davidi Franch)系龙胆科(Gentianaceae)獐牙菜属植物,为我国一种珍稀中草药药材,含有口山酮类、环烯醚萜类、三萜类和黄酮类等化学物质,其中口山酮类是其重要有效部分之一。本论文对川东獐牙菜中总口山酮的超临界CO2萃取分离工艺,超临界CO2萃取川东獐牙菜总口山酮指纹图谱,主要成分去甲基雏菊叶龙胆酮和1,8-二羟基-3,7-二甲氧基口山酮制备新方法、结构确证,标准品标准,含量测定方法、去甲基雏菊叶龙胆酮代谢动力学和激动GLP-1受体作用进行了研究,结果如下:(1)川东獐牙菜总口山酮萃取新工艺优化。采用正交设计对超临界CO2萃取方法进行工艺优化,结果表明:超临界CO2萃取川东獐牙菜总口山酮的最佳条件是温度40℃,压力30MPa,夹带剂为体积分数95%乙醇(用量为1.2L/kg药材),萃取80min,总口山酮萃取率1.61%,该工艺与采用有机溶剂提取方法比较,具有经济、环保、效率高和成本低的特点。(2)川东獐牙菜口山酮类成分标准品研究。经过反复研究,筛选出了硅胶G柱层析与微晶纤维素柱层析联用进行去甲基雏菊叶龙胆酮分离纯化和硅胶G柱层析与制备薄层联用进行1,8-二羟基-3,7-二甲氧基口山酮的分离纯化新方法,与已有文献报道方法比较,该方法简单、稳定、重现性好,迄今为止尚无文献报道;采用上述方法分离纯化获得去甲基雏菊叶龙胆酮和1,8-二羟基-3,7-二甲氧基口山酮成分,HPLC法标定纯度分别不低于99.30%和99.0%;经理化性质分析和波谱(UV、IR、EI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT)解析,上述化合物分别鉴定为去甲基雏菊叶龙胆酮(demethylbellidifolin)和1,8-二羟基-3,7-二甲氧基口山酮(methylswertianin);在此基础上完成了去甲基雏菊叶龙胆酮和1,8-二羟基-3,7-二甲氧基口山酮对照品制备与标准品标准的研究。(3)含量测定方法筛选。经过反复试验,确定了高效液相色谱测定总口山酮中有效成分去甲基雏菊叶龙胆酮HPLC方法,其最佳色谱条件:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Hypersil C18柱;150 mm×4.6 mm,5μm),柱温25℃,甲醇-0.5%磷酸水(56:44)为流动相,流速1mL/min,254nm检测;并进行了相应的方法学考察,稳定性、重现性和精密度RSD均小于3%,平均加样回收率99.97%(RSD=0.94%),去甲基雏菊叶龙胆酮在0.52～2.6μg ( r=0.9994 )范围内线性关系良好,其回归方程为:Y=7.0×106X+408893。该方法准确、简便,可以应用于川东獐牙菜药材的含量测定,三批测定结果表明,川东獐牙菜药材中去甲基雏菊叶龙胆酮含量0.752-0.770%。(4)超临界CO2萃取川东獐牙菜总口山酮指纹图谱研究。指纹图谱是控制复杂体系药物的有效方法,经过反复试验,筛选出了超临界CO2萃取川东獐牙菜总口山酮指纹图谱测定最佳色谱条件:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Hypersil C18柱;150 mm×4.6 mm,5μm),柱温20℃,甲醇-水(54:46)为流动相,流速1.3 mL/min,检测波长254 nm,方法学考察表明其稳定性和重现性RSD小于3%,可应用于川东獐牙菜总口山酮质量控制;通过10批次川东獐牙菜总口山酮提取物指纹图的测定,建立了川东獐牙菜总口山酮指纹图谱模式标准。(5)去甲基雏菊叶龙胆酮代谢动力学。建立了测定血浆中去甲基雏菊叶龙胆酮浓度的高效液相色谱法,并用于川东獐牙菜中去甲基雏菊叶龙胆酮在小鼠体内的药动学研究。去甲基雏菊叶龙胆酮的线性范围为0.048-4.8μg/ml(r=0.9996),方法适用于测定去甲基雏菊叶龙胆酮在小鼠体内的浓度。小鼠腹腔注射0.8g/kg的去甲基雏菊叶龙胆酮后其药动学参数为T1/2α为(19.800±4.831)min,T1/2β为(411.745±52.838)min,AUC为(92.246±10.906)mg·ml·min-1,去甲基雏菊叶龙胆酮在小鼠体内药动学符合二房室开放模型。(6)去甲基雏菊叶龙胆酮对GLP-1受体激动作用。将GLP-1受体质粒和报告基因质粒以l∶5的比例共转染到已贴壁培养1 d的HEK293细胞中,通过G418筛选,建立稳定的GLP-1受体细胞株。结果:去甲基雏菊叶龙胆酮能够激动GLP-1受体作用。上述结果为开发去甲基雏菊叶龙胆酮作为治疗糖尿病新药提供了实验依据。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
1 绪论  10-19
  1.1 川东獐牙菜研究进展  10-14
    1.1.1 化学成分研究进展  10-13
    1.1.2 川东獐牙菜药理作用研究进展  13-14
  1.2 口山酮研究进展  14-15
  1.3 超临界流体萃取技术  15-17
    1.3.1 超临界流体  16
    1.3.2 SFE 的特点  16
    1.3.3 SFE 在中草药中的应用  16-17
  1.4 小结与讨论  17-19
2 川东獐牙菜总口山酮的提取新工艺研究  19-28
  2.1 材料与仪器  19
  2.2 川东獐牙菜总口山酮提取最佳工艺研究  19-25
    2.2.1 正交实验设计  20-21
    2.2.2 正交实验结果  21-22
    2.2.3 数据分析  22-24
    2.2.4 工艺验证  24-25
  2.3 乙醇提取工艺  25
  2.4 丙酮提取工艺  25-26
  2.5 小结与讨论  26-28
3 川东獐牙菜口山酮类成分标准品研究  28-41
  3.1 实验材料与仪器  28-29
  3.2 提取、分离与纯化  29-30
  3.3 薄层色谱图（TLC）  30-33
    3.3.1 去甲基雏菊叶龙胆酮的TLC  30-31
    3.3.2 1，8-二羟基-3，7-二甲氧基口山酮的TLC  31-33
  3.4 HPLC 检测  33-34
    3.4.1 HPLC 检测去甲基雏菊叶龙胆酮  33
    3.4.2 HPLC 检测1，8-二羟基-3，7-二甲氧基口山酮  33-34
  3.5 结构确认  34-40
    3.5.1 化合物A 的结构确认  34-37
    3.5.2 化合物B 的结构确认  37-40
  3.6 小结与讨论  40-41
4 含量测定方法研究  41-51
  4.1 川东獐牙菜药材中总口山酮的含量测定  41-44
    4.1.1 仪器与试药  41
    4.1.2 方法与结果  41-44
  4.2 去甲基雏菊叶龙胆酮含量测定方法  44-50
    4.2.1 仪器与材料  44
    4.2.2 方法和结果  44-50
  4.3 小结和讨论  50-51
5 超临界 CO_2萃取川东獐牙菜总口山酮指纹图谱研究  51-58
  5.1 仪器与材料  51
  5.2 方法和结果  51-57
    5.2.1 药材粉碎度  51
    5.2.2 色谱条件  51
    5.2.3 对照品溶液的制备  51-52
    5.2.4 供试品溶液的制备  52
    5.2.5 方法学考察  52-55
    5.2.6 川东獐牙菜总口山酮样品指纹图谱模式标准的建立  55-57
  5.3 小结与讨论  57-58
6 去甲基雏菊叶龙胆酮代谢动力学研究  58-62
  6.1 材料与仪器  58
  6.2 实验内容与结果  58-61
    6.2.1 给药方式与血样的采集  58
    6.2.2 血样的处理  58
    6.2.3 血样测定  58-60
    6.2.4 实验结果  60-61
  6.3 讨论  61-62
7 去甲基雏菊叶龙胆酮激动 GLP-1 受体作用研究  62-67
  7.1 材料和方法  63-64
    7.1.1 药品和试剂  63
    7.1.2 仪器  63
    7.1.3 质粒构建  63-64
    7.1.4 稳定细胞株的建立  64
    7.1.5 酶报告基因表达量检测  64
  7.2 实验结果  64-66
    7.2.1 酶表达时间的确定  64
    7.2.2 孔板接种细胞数目的确定  64-65
    7.2.3 Bright Glo 试剂用量的确定  65
    7.2.4 GLP-1R 受体细胞株内内源性干扰检测  65
    7.2.5 去甲基雏菊叶龙胆酮(DMB)激动GLP-1 受体效果  65-66
  7.3 讨论  66-67
8 结论与展望  67-69
  8.1 结论  67
  8.2 展望  67-69
致谢  69-70
参考文献  70-74
附：  74-83
  A 化合物结构分析谱图  74-79
  B 去甲基雏菊叶龙胆酮标准物质标准  79-81
  C 1,8-二羟基-3,7 二甲氧基口山酮标准物质标准  81-83
  D 攻读硕士学位期间发表论文情况  83

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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