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香猪生长相关基因的结构与表达

作　者: 李景
导　师: 王嘉福；冉雪琴
学　校: 贵州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 生长激素基因 胰岛素样生长因子基因 克隆 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 114次
引　用: 2次
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内容摘要


哺乳动物的生长主要受生长激素、胰岛素样生长因子Ⅰ的调控，将生长激素基因和胰岛素样生长因子基因作为影响香猪生长速度的候选基因，克隆并分析基因的组织特异性表达规律并研究基因变异与香猪生长速度性状表型之间的关系。应用聚合酶链式反应技术从香猪的基因组文库中分离出1.903Kb生长激素基因，由五个外显子和四个内含子组成。香猪生长激素基因的碱基序列与已知四个国外猪种和9个中国地方猪种之间的相似性为97-99％，其间的差异集中在内含子2和4，通过限制性内切酶（DdeⅠ，NatⅠand BsmNⅠ）分析，鉴定出香猪生长激素基因的五个多态性位点，分别位于5’-侧翼区274（T／C）位点，外显子2的622（G／A）和631（G／A）位点，内含子2中的841（T／C）以及外显子4中的1358（A／G）位点。同时，1358（A／G）位的碱基改变导致香猪生长激素成熟肽第108位异亮氨酸替换，三维结构分析表明，异亮氨酸的存在可能影响香猪生长激素与受体的亲合力。为了检测香猪生长激素与受体亲和力关系的变化，将生长激素成熟肽置于原核表达系统中表达。以香猪脑垂体总RNA为模板，经RT-PCR扩增得到香猪生长激素cDNA，长700bp，回收后与载体DMD18-T相连，转化大肠杆菌TG1，筛选阳性克隆子，以重组质粒为模板，通过含有SapⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异引物将生长激素基因亚克隆到表达载体pTYB11上，野生型香猪生长激素的原核表达质粒pTYB11-wGH；采用定点突变PCR技校构建了含有Ile108突变的重组质粒pTYB11-mGH。二种重组质粒分别转化受体菌ER2566，在IPTG诱导下，二种蛋白在原核细胞中获得了表达，SDS-PAGE检测表达的融合蛋白的分子量为78KD，与预期相符；定量分析结果显示，表达的融合蛋白占菌体总蛋白的10％。该结果为进一步研究GH的结构、生物学活性及其与受体的相互作用等奠定了基础。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）分为IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ二种类型，在生长激素下游介导动物的生长。以香猪肝组织为实验材料，采用RT-PCR方法，克隆了完整的IGF-Ⅰ基因，测序结果分析表明该片段与已知猪种的IGFⅠ基因相似性为99％。以RT-PCR检测了IGF-Ⅰ基因在香猪组织中的表达，结果显示，IGF-Ⅰ主要在肝脏中表达，在脾、肺、软骨、脊髓、脂肪、子宫和肌肉组织中表达，肝脏中的表达量显著高于其它组织。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-21
  一、生长激素-胰岛素样生长因子概述  11-12
  二、猪生长激素的研究进展  12-14
    1 生长激素的结构  12-13
    2 生长激素的多态性  13
    3 猪生长激素基因研究动态  13-14
  三、生长激素受体的研究进展  14-15
    1、生长激素受体的基因结构  14-15
    2、生长激素受体的功能域  15
    3、生长激素受体的组织分布  15
  四、胰岛素样生长因子的研究进展  15-18
    1、胰岛胰岛素样生长因子Ⅰ的结构  16
    2、胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌  16
    3、胰岛素样生长因子Ⅰ的功能  16-17
    4、影响胰岛素生长因子Ⅰ组织表达的因素  17-18
  五、生长轴上信号转导途径  18-20
  六、本研究的目的和意义  20-21
实验材料与方法  21-37
  2.1 实验材料、试剂  21-24
  2.2 实验方法  24-37
结果  37-55
  一、贵州香猪生长激素基因DNA及cDNA序列和结果分析  37-43
    1.香猪生长激素基因克隆  37
    2 生长激素基因结构:  37-39
    3、pGH基因多态性分析:  39-41
    4、pGH成熟肽三维结构分析:  41-43
  二、生长激素蛋白突变体的构建表达及纯化  43-49
    1、RT-PCR扩增野生型及突变型的GH cDNA  43-45
    2、pMD-GH克隆载体的构建  45
    3、pTYB11-GH表达质粒的构建:  45
    4、 融合蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析  45-48
    5、蛋白纯化:  48-49
  三、 贵州香猪GHR基因mRNA组织表达  49-50
  四、贵州香猪胰岛素样生长因子Ⅰ  50-55
    1、贵州香猪IGFⅠ基因的克隆  50-53
    2、贵州香猪 IGF-Ⅰ基因mRNA组织表达  53-55
讨论  55-58
小结  58-60
致谢  60-61
参考文献  61-71
附录  71-73

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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