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限制性内切酶介导（REMI）玉米大斑病菌的遗传转化及其转化子表型分析

作　者: 刘丽华
导　师: 董金皋
学　校: 河北农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 玉米大斑病菌原生质体制备 REMI转化转化子表型分析
分类号: S435.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 87次
引　用: 4次
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内容摘要

玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)是一种世界性分布的重要丝状病原真菌，由其引起的玉米大斑病是一种重要的叶部病害，流行年份造成严重的经济损失。了解病菌的致病分子机理对其病害的有效防治具有重要意义。众所周知，鉴定病菌致病相关基因是了解病菌致病机理的关键，许多致病相关基因是通过DNA插入产生致病缺陷突变而分离得到的。限制酶介导整合转化(restriction enzyme-mediated integration，REMI)正被越来越多地应用于丝状真菌致病相关基因的标记与克隆。本研究通过在优化转化体系中的主要参数的基础上，建立了玉米大斑病菌的REMI转化体系。结果表明，玉米大斑病菌菌体的培养时间、细胞壁降解酶的种类、酶解时间、酶解温度以及再生培养基等一系列因素对原生质体释放及再生有明显的影响。根据研究结果规范出一套标准化的玉米大斑病菌原生质体制备方法：即(1)从PDA固体培养基上培养15d的菌落上洗下病菌的分生孢子：(2)将孢子按浓度10~5个/mL接种到改良Fries液体培养基中，25℃下振荡培养20h，过滤洗涤收集菌丝；(3)用12.5mg/mL溶壁酶、12.5mg/mL崩溃酶和12.5mg/mL蜗牛酶组成的混合酶在30℃，100rpm的条件下酶解4～5h；(4)将酶解好的原生质体的酶解溶液用3层擦镜纸的过滤：(5)用已灭菌的0.7M NaCl溶液冲洗，将冲洗液在3000rpm，4℃条件下离心10min，去上清，再用STC洗涤2次后得到所需浓度的原生质体。一般100mL菌丝培养液可以得到浓度为1.44×10~6个/mL的原生质体。利用限制酶介导DNA插入突变(REMI)转化玉米大斑病菌野生菌株01-23(WT)，共获得了215个玉米大斑病菌转化子。将这些转化菌株于PDA上培养5代(无性繁殖)，发现所有转化子各子代均能在含50μg/mL潮霉素的PDA培养基上生长，而野生菌株01-23不能生长，说明转化子在遗传上是稳定的。对这些突变体的基因组进行了PCR扩增，发现所有参试基因组中都能扩增到潮霉素磷酸转移酶基因(hph)序列，表明突变体的基因组中确实已经携带hph基因序列。经对所得的215个转化子进行生长速度和产孢量测定，发现3个转化子的产孢量低于野生菌株01-23，其中转化子M25已丧失产孢能力，对转化子M25进行致病性分析，发现其致病性减弱。此外，有3个转化子的产孢量较野生菌株升高。对所有转化子在PDA上生长速度的测定，结果发现5个转化子的生长速度和野生菌株相比有不同程度的减慢。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-13
2 材料和方法  13-23
  2.1 材料  13-14
    2.1.1 供试菌株与转化质粒  13
    2.1.2 供试培养基  13-14
    2.1.3 试剂  14
    2.1.4 溶液的配制  14
    2.1.5 主要仪器和设备  14
  2.2 方法  14-23
    2.2.1 细菌的转化  14-15
    2.2.2 质粒的提取  15-16
    2.2.3 原生质体制备与再生  16-17
    2.2.4 REMI 转化及转化子潮霉素抗性的稳定性检测与保存  17
    2.2.5 突变菌株的分子生物学检测  17-19
    2.2.6 突变体的质粒拯救与鉴定  19-20
    2.2.7 突变体的生物学性状观察  20-21
    2.2.8 突变菌株致病性鉴定  21-23
3 结果与分析  23-38
  3.1 质粒的提取  23
  3.2 原生质体制备及纯化条件的确定  23-29
    3.2.1 制备原生质体的菌体培养条件  23-25
    3.2.2 酶系统以及酶解条件的选择  25-26
    3.2.3 玉米大斑病菌原生质体的获得  26
    3.2.4 原生质体的纯化  26-27
    3.2.5 原生质体的收集方式对原生质体纯度的影响  27-28
    3.2.6 原生质体的再生  28-29
    3.2.7 潮霉素对玉米大斑病菌的抑制浓度  29
  3.3 REMI 遗传转化与转化子的获得  29-30
  3.4 突变体的检测  30-31
    3.4.1 突变体插入稳定性检测  30
    3.4.2 PCR 验证  30-31
  3.5 突变体的表型分析及致病性测定结果  31-35
    3.5.1 突变菌株生长速度的测定  31
    3.5.2 菌落形态观察  31-32
    3.5.3 转化子分生孢子的显微特征比较  32-33
    3.5.4 突变菌株分生孢子产生能力测定  33
    3.5.5 分生孢子萌发率的测定  33-34
    3.5.6 突变菌株粗毒素的生物活性测定  34-35
    3.5.7 突变菌株致病力测定  35
  3.6 典型突变体 M25 的分析  35-38
    3.6.1 菌落生长速度和菌落形态  36
    3.6.2 产孢量的比较  36-37
    3.6.3 致病性的鉴定  37-38
4 讨论  38-40
  4.1 关于原生质体的制备  38
  4.2 玉米大斑病菌的 REMI 诱变  38-39
  4.3 关于产孢相关突变体的筛选  39
  4.4 有待进一步研究的问题  39-40
5 结论  40-41
参考文献  41-46
在读期间发表的学术论文  46-47
个人简历  47-48
致谢  48-49
附录  49-50

限制性内切酶介导（REMI）玉米大斑病菌的遗传转化及其转化子表型分析

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