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黄芩对大鼠原代肝细胞中CYP450 3A1的影响

作　者: 顾宪锐
导　师: 钟秀会；马玉忠
学　校: 河北农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 黄芩 大鼠 原代肝细胞 酒精性肝损伤 CYP450 3A1
分类号: S853.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


运用大鼠原代肝细胞的体外培养和Western blotting等技术，探讨了传统中药黄芩及其单体成分黄芩苷、汉黄芩素等对肝细胞中CYP450 3A1的影响，旨在探讨黄芩体外药物代谢的分子机制，为临床用药提供理论依据，以达到合理用药、安全用药的目的。采用胶原酶二步灌流法获取大鼠肝细胞，用不同浓度的黄芩苷、汉黄芩素、黄芩苷-汉黄芩素(1：1)、黄芩粗提物(自制)对肝细胞进行处理，24h、48h后分别裂解细胞内的蛋白质并测定其浓度，用Western blotting法测定肝细胞中CYP450 3A1含量的变化。用不同浓度的乙醇作用于大鼠肝细胞，分别在6h、12h、24h收取上清液和细胞内的蛋白，MTT法测细胞存活率，以上清液中ALT、AST、LDH作为生化指标。从上述试验中选出合适的乙醇浓度制备肝损模型，并用黄芩及其单体成分进行保肝试验，测定ALT、AST、LDH等指标，用Western blotting法测定肝细胞中CYP450 3A1含量的变化。胶原酶两步灌流法获得了大鼠原代肝细胞20ml，密度为1-2×10~7个／ml，成活率95％左右。黄芩苷、汉黄芩素、黄芩粗提物分别在2、0.05、50μg/ml时，黄芩苷-汉黄芩素共同作用24h、48h时，蛋白保持在较高水平；随着黄芩苷、汉黄芩素、黄芩苷-汉黄芩素浓度的增加，各蛋白样品中CYP450 3A1的含量呈明显逐渐减少的趋势，黄芩粗提物也呈减少趋势但不如单体成分明显。50mmol／L乙醇作用12h，肝细胞ALT、AST、LDH值与阴性对照相比差异均显著；乙醇作用肝细胞6h、12h、24h，对CYP4503A1均无明显影响。黄芩苷与乙醇共同作用肝细胞，肝细胞存活率、ALT、AST、LDH与阴性对照相比均呈显著差异的状态；汉黄芩素与乙醇共同作用肝细胞，在浓度为1.0μg／ml时，ALT、AST、LDH与阴性对照比差异均显著，但肝细胞存活率下降明显；黄芩苷-汉黄芩素与乙醇共同作用肝细胞，ALT、AST、LDH与阴性对照比差异均显著，但肝细胞存活率下降明显；黄芩粗提物与乙醇共同作用肝细胞，AST与阴性对照相比差异显著，在10μg／ml时，ALT、AST、LDH与阴性对照比均差异显著，肝细胞存活率下降不明显。黄芩苷、汉黄芩素、黄芩粗提物均具有保护肝细胞的作用，而黄芩苷的保肝作用尤为明显，黄芩苷体外作用的最佳浓度为2μg／ml，汉黄芩素最佳浓度为0.05μg／ml，但毒性很大，黄芩粗提物最佳浓度为50μg／ml，黄芩苷-汉黄芩素合用扩大了安全浓度使用范围。黄芩苷、汉黄芩素对大鼠原代肝细胞中CYP450 3A1具有明显的抑制作用；黄芩粗提物对CYP450 3A1也有抑制作用，但不如单体成分明显。乙醇对大鼠原代肝细胞具有明显的损伤作用，50mmol／L最适合做肝损模型。乙醇对大鼠原代肝细胞中CYP450 3A1无明显的抑制或诱导作用，既乙醇不依赖于CYP450 3A1来代谢。黄芩苷、黄芩粗提物对乙醇造成的大鼠肝细胞损伤均具有显著的保护作用，但他们的保护机制不是通过抑制CYP450 3A1的表达来完成。汉黄芩素保肝作用不是很明显。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-15
2 材料和方法  15-24
  2.1 主要材料与仪器  15-16
    2.1.1 试验动物  15
    2.1.2 主要药品与试剂  15
    2.1.3 主要实验器材  15-16
  2.2 方法  16-23
    2.2.1 肝细胞培养前的准备  16-18
    2.2.2 肝细胞的培养及药物的处理  18-22
    2.2.3 肝损模型的建立  22-23
    2.2.4 进行肝损和肝保药物的试验  23
  2.3 统计处理  23-24
3 结果  24-41
  3.1 黄芩单体成分直接作用于原代肝细胞  24-31
    3.1.1 大鼠原代肝细胞的形态  24
    3.1.2 黄岑苷作用后蛋白样品浓度  24-26
    3.1.3 汉黄芩素作用后蛋白样品浓度  26-27
    3.1.4 黄芩粗提物作用后蛋白样品浓度  27-28
    3.1.5 黄芩苷汉黄芩素作用后蛋白样品浓度  28-30
    3.1.6 Western bloting结果  30-31
  3.2 乙醇肝损伤模型结果  31-35
    3.2.1 乙醇作用6、12、24h时ALT、AST、LDH和肝细胞存活率的变化  31-33
    3.2.2 乙醇作用后蛋白样品浓度  33-35
    3.2.3 乙醇作用后Western bloting结果  35
  3.3 肝损-肝保试验结果  35-41
    3.3.1 黄芩与乙醇共同作用12h后ALT、AST、LDH和肝细胞存活率的变化  35-38
    3.3.2 黄芩各成分与乙醇共同作用肝细胞12h各孔蛋白浓度  38-39
    3.3.3 Western blotting结果  39-41
4 讨论  41-47
  4.1 黄芩的保肝作用及对正常肝细胞中CYP450 3A1的影响  41-42
  4.2 乙醇对大鼠原代肝细胞的损伤作用  42-43
  4.3 黄芩单体成分抗试验性肝损伤的研究  43-47
5 结论  47-48
参考文献  48-54
附录  54-56
在读期间发表的学术论文  56-58
作者简历  58-59
致谢  59-60
附录  60-78

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