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凋亡相关新基因apr-2的克隆、表达及多克隆抗血清的制备

作　者: 李袁飞
导　师: 师建国
学　校: 第四军医大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: apr-2 凋亡克隆原核表达融合蛋白多克隆抗血清
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

细胞凋亡，又称程序性死亡，具有广泛及重要的生理和病理意义，由多种促进细胞死亡或延长细胞生存的基因及其产物所调控。目前认为调节细胞凋亡的相关基因主要有：抑制凋亡基因、促进凋亡基因、以及细胞凋亡过程中表达的基因。现已知道凋亡与恶性肿瘤、造血系统疾病，感染性疾病等多种疾病的发生发展密切相关。研究者已经尝试通过调节细胞凋亡机制的核心成份，例如BCL2蛋白家族、细胞内抗凋亡蛋白，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)等来诱导癌细胞的凋亡。几种凋亡诱导剂已应用于癌症的治疗，并显示出较好的应用前景。对肿瘤凋亡机制深入研究，其最终目的一方面是为化学治疗提供更多、有效、特异的治疗靶点；另一方面通过调节和控制凋亡的过程，克服和解决肿瘤治疗中的耐药性问题，提高临床疗效。在凋亡研究过程中，每一个与凋亡密切相关的新基因的发现，都会深化人们对凋亡机制的了解，引发人们对许多疾病发生、发展进行新的思考。朱峰等人通过建立急性早幼粒白血病细胞(HL-60)凋亡模型，运用改良消减杂交法(ISH)克隆出了一系列新基因，认为与细第四军医大学硕士学位论文胞凋亡相关，分别命名为apr一1一即r一5，并在GeneBank中登录。aPr一2是其中之一，全长79lbp，位于第17号染色体，其eDNA编码区为339bp，编码In个氨基酸。但该基因的结构、功能以及与细胞凋亡的确切关系目前还不清楚，国内外文献尚无研究报道。我们通过克隆apr一2编码区基因，.获得APR一2原核表达蛋白和抗血清，为进一步对该基因的研究莫定基础。本研究进行了如下四方面实验:1.利用全反式维甲酸(ATRA)建立HL一60细胞凋亡模型，提取HL一60凋亡细胞总RNA，根据GeneBank中apr一2 CDNA编码区序列设计引物，采用RT一PCR方法获取apr一2 cDNA编码区序列，回收纯化后与PGEM--T Easy载体连接，转化大肠杆菌，构建重组克隆载体PGEM一T Easy/apr一2，进行序列分析。2.测序正确后，将目的片段亚克隆入PGEX一4T一2原核表达载体，转化大肠杆菌，异丙基硫代一p一D一半乳糖昔(IPTG)诱导重组融合蛋白小样表达，确定目的基因的表达情况后，进一步大量表达，利用凝胶自动扫描分析目的蛋白在细菌中的表达分布。运用电洗脱方法对获得的融合蛋白进行初步纯化。3.用获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔多克隆抗血清，饱和硫酸胺法纯化，酶联免疫反应(EL工SA)检测抗血清滴度，运用 western一blot检测融合蛋白的免疫原性。4.全反式维甲酸培养HL一60细胞12h后，提取细胞总蛋白，利用制备的兔多克隆抗血清，对APR一2进行western一blot检测。结果:提取的HL一60凋亡细胞总RNA，经RT一PCR后，获得一条约339bp的DNA电泳条带，产物分别与PGEM一T Easy和PGEX一4T一2载体连接并转化大肠杆菌后得到阳性克隆，经序列分析表明，与GeneBank中已登录的apr一2 cDNA编码区序列完全一致。证明我们成功地构建了重组克隆载体PGEM一T一Easy/apr一2和原核表达载体PGEX一4T一2/aPr一2。将载有目的片段的PGEX一4T一2重组表达载体，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导融合蛋白GST一APR一2表达，凝胶自动扫描分析显示表达的融合蛋白占菌体总蛋白的30%以上，主要以包涵体的形式存在。用融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔多克隆抗血清，间接ELISA检测抗血清效价约为1:5000。用Western一blot检测抗原(纯化的蛋白质)的免疫原性，显示原核表达的第四军医大学硕士学位论文蛋白可与多克隆抗血清特异的结合，形成单一的结合条带，且上样量与免疫印迹条带大小呈正相关。利用已制备的兔多克隆抗血清Western一blot检测全反式维甲酸培养12h后的HL一60细胞，在约12KD左右形成清晰的单一条带。结论:成功地获得了细胞凋亡模型HL一60中aPr一2 cDNA编码区的克隆。成功地进行APR一2的融合表达，并获得了该蛋白的兔多克隆抗血清，对该蛋白在 HL一60凋亡细胞中的表达状态进行初步研究。为aPr一2的功能研究及进一步阐明细胞凋亡的机制奠定基础。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-14
文献回顾  14-27
  一、凋亡的特征及生物学意义  14-15
  二、凋亡相关基因及分子机制  15-19
  三、凋亡与疾病的关系  19-22
  四、靶向凋亡通路的抗癌药物新进展  22-27
正文  27
实验材料  27-33
实验一凋亡相关新基因apr-2的克隆及序列分析  33-41
  1 实验方法  33-36
  2 实验结果  36-39
  3 讨论  39-41
实验二 APR-2的融合表达及初步纯化  41-46
  1 实验方法  41-42
  2 实验结果  42-44
  3 讨论  44-46
实验三 APR-2兔多克隆抗血清的制备  46-51
  1 实验方法  46-48
  2 实验结果  48-50
  3 讨论  50-51
全文总结  51-53
参考文献  53-62
个人简历和研究成果  62-63
致谢  63

凋亡相关新基因apr-2的克隆、表达及多克隆抗血清的制备

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