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黑熊—家猫种间体细胞核移植研究

作　者: 刘志春
导　师: 张生勇；李六金
学　校: 中国人民解放军第四军医大学
专　业: 药物化学
关键词: 黑熊家猫体细胞核移植
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

本研究运用体细胞核移植的原理和技术，以六月龄雌性黑熊的成纤维细胞为供核体，去核未受精家猫成熟卵母细胞为受体，构建种间核移植重组胚胎，研究种问体细胞核移植胚胎的构建方法和重组胚胎的体内外发育潜能及其影响因素。并重点讨论影响种间核移植重组胚胎发育的主要因素。主要内容和结果如下：（一）黑熊成纤维细胞的分离培养和纯化从黑熊耳缘皮肤和颈部皮肤取材，采用组织块培养法分离培养黑熊皮肤成纤维细胞，在DMEM和RPMI1640两种培养基中分别添加10％的胎牛血清，均可满足黑熊皮肤成纤维细胞的体外生长和传代。通过单细胞集落显微法纯化细胞，可克服单细胞克隆中因细胞密度太低，难以形成克隆的缺点，而且操作简单，效率高，速度快，其克隆率可达93.75％。（二）黑熊成纤维细胞的同步化处理和流式细胞仪分析分离培养黑熊皮肤成纤维细胞，连传3代，分别经血清饥饿2d、3d、4d、5d、6d处理和10μg／ml Nocodazole处理24h。流式细胞仪分析结果表明，血清饥饿处理能较好地使黑熊成纤维细胞同步于G₀和G₁期，其中饥饿3d时，G₀+G₁期的细胞所占百分率最高，达到（85.05±7.0）％；而Nocodazole处理第四军医大学硕士学位论文则使细胞较大程度同步于 G。和 M期，达到（46．3024卫0）％。两种同步化处理与未处理组细胞周期有显著差异T＜0刀引。（三）超数排卵获取家猫成熟卵母细胞的研究用促卵泡素（FSH），聚乙烯毗咯烷酮（PVP）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）建立家猫的超数排卵方法。结果表明，FSH＋HCG组与田H＋30％PVP＋HCG组收集成熟卵母细胞数（FSH 100单位／只剂量时）分别为旧．8t3．71枚、19．liZ，77枚；可用卵数分别为IZ．4t2．88枚、12．7t2．41枚，比非激素处理的对照组高出3倍以上，与对照组有显著差异T＜0刀1)。但两组超排效果在同一剂量无显著差异（P为刀5），1m单位”H／只的剂量超排效果最好，最多者可达 25枚成熟卵母细胞，可用卵数为 12．5522石5枚。（四）黑熊－家猫种间体细胞核移植研究主要结果 1．经血清饥饿3d、4d、sd同步化处理构建的重组胚，其桑堪胚发育率分别为20．22％、18．31％、门石5％，明显高于对照组6．89％和Nocodazole处理组 9．76％（P＜0刀5）；NoCodazole处理组与对照组卵裂率差异显著（P＜0刀5），而桑堪胚发育率无显著差异T＞O刀引；经川、叩、扣血清饥饿处理构建的重构胚，卵裂率和桑堪胚发育率无显著差异o＞0刀引。对照组和同步化处理组构建的重组胚均不能发育到囊胚，其机理有待进一步的研究。 2．研究表明，10 u g／ml的 CCB有利于去核，去核率为 87刀6％。 3．用乙醇＋6－DMAP＋CCB、乙醇＋CHX＋CCB、Sr’”＋CCB等3种方法激活重组胚胎，结果表明，3种激活方法对黑熊－家猫的核移植胚胎都有激活作用，其中乙醇＋6－DMAP＋CCB的激活效果最好，在 TCM 99成熟培养液中培养 36 h后，卯裂率达到 66．09％，桑褡胚发育率达到 26．95％。 4．直接注射法构建的核移植重组胚胎的桑堪胚发育率（25．95％）高于电融合法（16．07％），统计学分析差异显著（P＜0．05）。当电场强度为 1800V／CC，脉冲宽度为 30ms时，融合率最高，达到引．38％；当电场强度为 2400 V／cm，脉冲宽度为 40ms时，重组胚胎崩解。－3－一 5．重组胚在3种培养液中的发育能力有差异T＜0刀引，＊＊M199成熟培养液比DMEM12、M16更能支待重组胚胎的卵裂和桑棋胚发育，卵裂率和桑堪胚发育率分别为 63．39％、25．89％；DMEM／F12、M16对黑熊－家猫种间核移植重组胚的体外培养无显著差异T劝刀引。重组胚胎在3种培养液中没有得到囊胚期的胚胎。 6．将体外发育到2一胞至桑褡胚时期的194枚重组胚，分别移植给同期发情的 20只假孕雌猫的输卵管伞、输卵管和子宫角。结果表明，2一胞至桑堪胚时期的重组胚未能妊娠和产子，其原因有待进一步的研究和探索。结论：本研究在国内外首次进行黑熊－家猫种间体细胞核移植研究，初步建立了种间体细胞核移植重组胚的构建方法，并获得发育至桑棋胚的黑熊－家猫胚胎，但没有得到囊胚，2＞胞至桑堪胚的重组胚移植给受体动物（雌猫），均未妊娠。说明家猫的去核成熟卵母细胞质能支持黑熊成纤维细胞进行发育程序重编，尚不能维持重组胚胎的囊胚发育和妊娠，其机理还有待进一步的研究。另外，供体细胞的同步化处理、卵母细胞的质量、重组胚胎的构建。激活方法、培养系统等因素都影响异种核移植胚胎的发育。

黑熊—家猫种间体细胞核移植研究

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